動態(tài)壓力聯(lián)合IGF-1基因轉染促進兔脂肪間充質干細胞成軟骨分化及HIF-1α表達的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 觀察動態(tài)機械壓力聯(lián)合IGF-1基因轉染對兔脂肪間充質干細胞(ADSCs)HIF-1α表達的影響,并探討HIF-1α促進成軟骨分化的作用機制。
　　 方法：
　　 1、無菌條件下切取成年新西蘭大耳白兔頸后部皮下脂肪組織,采用Ⅰ型膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)的方法,分離、純化、體外擴增兔ADSCs。
　　 2、在脂質體介導下,構建穩(wěn)定表達pcDNA3.1-IGF-1的細胞株,應用RT-PCR法檢測轉染后

2、細胞中IGF-1的表達。
　　 3、實驗細胞以5x107/ml的密度接種于殼聚糖/明膠復合支架材料上,分組培養(yǎng):A組(空白對照組)接種未轉染基因的脂肪間充質干細胞,B組(IGF-1組)接種穩(wěn)定轉染胰島素樣生長因子1的脂肪間充質干細胞,C組(壓力組)與D組(壓力+IGF-1組)分別為A、B組的細胞/支架復合物于壓力型生物反應器中動態(tài)培養(yǎng)(2％at0.1Hz),每天4小時(加壓20min-間歇20min,6個循環(huán)),連續(xù)培養(yǎng)7天。<

3、br>　　 4、觀察各組大體形態(tài),比較彈性模量的差異。
　　 5、掃描電鏡觀察細胞形態(tài)和其在支架材料上的貼附伸展情況。
　　 6、MTT法繪制細胞/支架復合物的增殖曲線,并應用Dil熒光標記觀察細胞增殖及分布情況。
　　 7、1,9-二甲基亞甲藍(DMMB)法定量測定糖胺聚糖(GAG)含量。
　　 8、Real time PCR定量檢測組織工程軟骨中IGF-1,HIF-1α,Ⅱ型膠原(COLⅡ)和Sox

4、-9基因的相對表達。
　　 結果：
　　 1、成功分離、純化、培養(yǎng)兔ADSCs,貼壁生長后,原代及傳代細胞生長狀態(tài)良好,形態(tài)為長梭性。
　　 2、成功構建穩(wěn)定表達pcDNA3-1-IGF-1的細胞株,RT-PCR檢測結果證實轉染后的細胞株在mRNA水平上獲得IGF-1的表達。
　　 3、肉眼見壓力與IGF-1基因轉染聯(lián)合培養(yǎng)組(D組)的細胞/支架復合物表面光滑,有光澤,彈性好。彈性模量比較:A組

5、組　　 4、掃描電鏡示各組細胞生長旺盛,在支架上附著、伸展良好,其中D組細胞生長最好,密度較高,形態(tài)飽滿,細胞成片,可見明顯的細胞外基質分泌。
　　 5、MTT提示細胞增殖能力:A組　　 6、GAG含量測定結果顯示:A組

6、G含量明顯高于其它各組,P<0.01。
　　 7、Real time PCR結果提示各組細胞/支架復合物中的IGF-1,HIF-1α,Ⅱ型膠原和Sox-9基因的相對表達均存在統(tǒng)計學差異,P<0.01。實驗證實單純基因轉染組的HIF-1α、Sox-9等基因表達水平明顯高于單純壓力組,而二者聯(lián)合培養(yǎng)則能夠獲得更為顯著的效果,其基因表達量遠大于二者簡單加和的結果。
　　 結論：
　　 1、IGF-1基因轉染能夠有效促進

7、兔ADSCs成軟骨細胞分化,使之可以成為優(yōu)秀的組織工程種子細胞。
　　 2、殼聚糖/明膠復合支架材料可以作為兔ADSCs三維立體培養(yǎng)的載體,為其提供粘附生長、向軟骨細胞分化、合成和分泌細胞外基質(ECM)的場所。
　　 3、IGF-1基因轉染明顯上調兔ADSCs HIF-1α的表達水平。
　　 4、周期性動態(tài)壓力增加HIF-1α表達,同時刺激細胞自身分泌力敏感因子--IGF-1,從而上調軟骨細胞相關基因的表達,促