胚胎神經(jīng)干細胞通過調(diào)控小膠質(zhì)細胞活性促進小鼠腦片神經(jīng)元的存活.pdf

1、神經(jīng)元的丟失是神經(jīng)退行性疾病如Parkinson disease(PD)和Alzheimer's disease(AD)的重要共同特征之一。在PD病人中的研究證明利用干細胞分化為特定的類型的細胞替代宿主丟失的神經(jīng)元有著令人期望的前景。然而在那些神經(jīng)元丟失發(fā)生于受累廣泛的腦區(qū)的神經(jīng)退行性疾病中，干細胞替代治療并沒有明顯效用。而且有很多研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)退行性疾病病程中，神經(jīng)元代謝能力的受損遠早于其丟失，因此使這部分受損神經(jīng)元逃逸退化、死亡可能

2、是更吸引人的治療神經(jīng)退行性疾病的方法。事實上，有很多研究提示神經(jīng)干細胞的這一保護作用在神經(jīng)元逃逸退化、死亡上的利用。另外有大量研究顯示神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元的退化死亡與小膠質(zhì)細胞的活性息息相關(guān)的，那么神經(jīng)干細胞促進神經(jīng)元逃逸退化死亡是否是由于調(diào)控了小膠質(zhì)細胞的活性？
　　為驗證假設(shè)，本實驗首先使用拉頸處死的小鼠前額葉皮層組織切片(n=16)與小鼠胚胎來源的神經(jīng)干細胞（孕14天）體外隔離式共培養(yǎng)，對腦組織進行細胞活性檢查(live/

3、deadkit)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):
　　1.胚胎神經(jīng)干細胞與腦片共培養(yǎng)可以促進腦組織中神經(jīng)元的存活
　　相對于對照組（作為干細胞的對照），神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)組的腦片有更多的存活細胞(p＜0.001)和更少的死細胞(p＜0.001)，但總細胞數(shù)卻明顯減少(p＜0.001)，而且共培養(yǎng)組的腦片中間態(tài)細胞和死細胞的數(shù)目隨培養(yǎng)天數(shù)逐漸減少，存活細胞占總細胞的百分比隨培養(yǎng)天數(shù)逐漸增加。
　　2.胚胎神經(jīng)干細胞促進腦片中小膠質(zhì)細胞的活化:

4、
　?、傩∧z質(zhì)細胞的抑制劑minocycline能顯著抑制神經(jīng)元的存活。小膠質(zhì)細胞的激動劑CpG-ODN可以模擬神經(jīng)干細胞的效應(yīng)，促進腦片中神經(jīng)元的存活。
　?、诟杉毎才囵B(yǎng)組的腦片中l(wèi)ocomotory型小膠質(zhì)細胞明顯多于對照組，motile型小膠質(zhì)細胞明顯少于對照組;
　?、蹖崟r定量PCR結(jié)合westernblot從mRNA到蛋白水平檢測了小膠質(zhì)細胞活化markerIBA1的表達水平，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組的腦片中IBA1蛋

5、白及mRNA水平均顯著高于對照組，免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)與干細胞共培養(yǎng)組腦片中小膠質(zhì)細胞IBA1陽性細胞數(shù)多于對照組;
　?、馨l(fā)現(xiàn)與干細胞共培養(yǎng)組小膠質(zhì)細胞的效應(yīng)分子的改變，神經(jīng)干細胞顯著降低了TNFαmRNA的表達，但顯著升高IL-10mRNA的表達;神經(jīng)干細胞顯著增強小膠質(zhì)細胞保護型表型的分子CX3CR1、IGF-1和TREM2mRNA的表達;
　　3.神經(jīng)干細胞通過TLR9-ERK1/2信號通路誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞激活
　

6、　①發(fā)現(xiàn)近年來報道與小膠質(zhì)細胞激活有關(guān)的TLR9的mRNA水平在共培養(yǎng)組明顯高于對照組;
　?、诎l(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組的腦片中ERK1的磷酸化水平顯著高于對照組。
　?、郯l(fā)現(xiàn)TLR9表達、ERK1磷酸化水平與IBA-1的表達有顯著相關(guān)性。
　?、芾迷∧z質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞系BV2與神經(jīng)干細胞進行隔離式共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細胞顯著增強TLR9和IBA-1蛋白的表達，并增強ERK1的磷酸化水平。TLR9抑制劑氯喹的處理顯著降低T

7、LR9、IBA-1蛋白的表達及ERK1的磷酸化水平，但ERK1/2抑制劑U0126可以顯著降低ERK1磷酸化水平和IBA-1的表達，卻不能降低TLR9的表達水平。另外，TLR9配體CpG-ODN顯著性增強TLR9、ERK1磷酸化水平和IBA-1蛋白表達，CpG-ODN和氯喹同時處理降低了CpG-ODN誘導(dǎo)的ERK1/2，IBA-1和TLR9的表達，但是CpG-ODN和U0126同時處理降低了CpG-ODN誘導(dǎo)的ERK1/2，IBA-1表

8、達，但是不能降低CpG-ODN誘導(dǎo)的TLR9表達。
　　4.自噬蛋白可能參與神經(jīng)干細胞促進腦片神經(jīng)元存活
　　①透射電鏡發(fā)現(xiàn)與干細胞共培養(yǎng)的組腦片中形態(tài)清晰的細胞中均含有大量的自噬體，而對照組則幾乎沒有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象;且自噬蛋白Beclin1蛋白水平及mRNA水平在與干細胞共培養(yǎng)的腦片中確實顯著高于對照組。
　　綜上所述，本實驗采用小鼠腦組織與胚胎神經(jīng)干細胞球非接觸式的共培養(yǎng)方法，進一步證實神經(jīng)干細胞對于小鼠離體培養(yǎng)的腦片