氧化鋅對斷奶仔豬腸上皮屏障的影響及其分子信號機理.pdf

1、本論文旨在研究氧化鋅對斷奶仔豬腸上皮屏障的影響并探究其防治斷奶仔豬腹瀉的分子信號機理。通過體內實驗研究了氧化鋅對斷奶仔豬生長、腹瀉、應激狀況、腸道菌群、腸道屏障和腸道炎癥的影響。在此基礎上通過體外試驗進一步探索氧化鋅保護腸道屏障的分子信號機制，解析其發(fā)揮作用的信號途徑以及關鍵調控靶點，為氧化鋅替代產品的開發(fā)和有效解決斷奶仔豬腹瀉問題提供科學依據(jù)。主要研究結果如下:
　　1.氧化鋅對斷奶仔豬生長、腹瀉和腸道菌群的影響
　　試驗

2、選取日齡（21±1d）和體重(6.1±0.4kg)相近“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬40頭，隨機分成2組，單欄飼養(yǎng)，分別飼喂基礎日糧（對照組）、基礎日糧+2200mg/kg氧化鋅形式的鋅（氧化鋅組）。試驗期14d，于斷奶后第7d和14d屠宰取樣待測。結果表明:1）氧化鋅顯著提高了仔豬斷奶后0-7d和7-14d平均日增重和日采食量(P＜0.05)，對料重比影響不顯著(P＞0.05)，降低了仔豬斷奶后4-14d腹瀉率和4-11d的糞便指數(shù)(

3、P＜0.05)。2)氧化鋅對斷奶后第1d、2d和7d仔豬血漿皮質醇和促腎上腺激素釋放激素(CRH)含量影響不顯著(P＞0.05)，顯著降低了斷奶后第7天腸黏膜CRH表達和含量(P＜0.05)。3)腸道菌群16SrRNA熒光定量結果發(fā)現(xiàn)，氧化鋅對大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量影響不顯著(P＞0.05)，顯著提高了乳酸桿菌/大腸桿菌比例(P＜0.05);高通量測序結果表明，氧化鋅顯著提高了Weissella、Leuconostoc、Streptoc

4、occus相對豐度(P＜0.05)，降低了Sarcina相對豐度(P＜0.05)，對Clostridium、Enterococcus、nterobacter和Lactobacillus相對豐度影響不顯著（P＞0.05），顯著提高了腸道菌群的OTU數(shù)和Shannon指數(shù)(P＜0.05)。4)氧化鋅顯著降低了仔豬斷奶后第7d仔豬血漿內毒素濃度和第7d和14d腸系膜淋巴結細菌移位率(P＜0.05)。結果表明，氧化鋅對大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量影響

5、不顯著，降低了血漿內毒素含量和細菌移位;提示氧化鋅可能不通過直接殺滅腸道細菌，而通過影響腸道屏障功能，緩解斷奶仔豬腹瀉。
　　2.氧化鋅對斷奶仔豬腸道屏障和MAPKs通路的影響
　　本試驗研究了氧化鋅對斷奶仔豬腸黏膜屏障功能的影響。測定了氧化鋅對仔豬斷奶后7d和14d仔豬空腸絨毛形態(tài)、屏障功能、緊密連接蛋白表達以及MAPKs信號通路的影響。結果表明:1）氧化鋅顯著提高了斷奶后7d空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度(V/C)(P

6、＜0.05)，而對隱窩深度影響不顯著(P＞0.05)。2）氧化鋅顯著提高了斷奶后7d和14d仔豬空腸跨上皮電阻(TER)值(P＜0.05)，降低了斷奶后第7d FD4通透性和血漿DAO活性(P＜0.05)。3)氧化鋅顯著提高了斷奶后第7d空腸黏膜Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達(P＜0.05)。4)氧化鋅顯著提高了斷奶后7d仔豬空腸黏膜ERK1/2激活(P＜0.05)，降低了p38和JNK激活(P＜0.05)。結果提

7、示，氧化鋅保護了斷奶仔豬腸道屏障，激活了ERK1/2通路，抑制了p38和JNK通路。
　　3.氧化鋅對斷奶仔豬腸道炎癥的影響
　　腸道炎癥是斷奶引起的腸道屏障損傷的重要因素。本試驗研究了氧化鋅對斷奶后仔豬空腸黏膜炎癥因子表達和含量、TLR和NOD受體信號通路和肥大細胞的影響，旨在探究氧化鋅對斷奶仔豬腸道炎癥的影響及可能機制。結果表明:1）氧化鋅顯著降低了斷奶后第7d仔豬空腸黏膜TNF-α、IFN-γ、CXCL2和IL-6的表

8、達和含量(P＜0.05)，顯著提高了斷奶后第7d和14d TGF-β1的表達和含量(P＜0.05)。2)氧化鋅顯著降低了斷奶后7d仔豬空腸TLR4、MyD88、IRAK1、TRAF6表達(P＜0.05)，對NOD1、NOD2、RIPK2、NF-κB p65表達影響不顯著(P＞0.05)，降低了仔豬空腸NF-κB p65蛋白表達(P＜0.05)，對caspase-3、HSP70表達影響不顯著（P＞0.05）。3）氧化鋅顯著降低了仔豬空腸肥

9、大細胞數(shù)量、組胺和tryptase的含量(P＜0.05)，提高了chymase陽性肥大細胞數(shù)量(P＜0.05)。4)離體實驗發(fā)現(xiàn)氧化鋅組仔豬空腸對CRH引起的屏障功能損傷、肥大細胞脫顆粒等敏感性顯著降低(P＜0.05)。結果提示，氧化鋅降低了TLR4通路信號分子和NF-κB表達，影響了肥大細胞數(shù)量、活性和類型，降低了腸道對CRH敏感性，緩解了腸道炎癥。
　　4.氧化鋅通過ERK1/2通路緩解了TNF-α/IFN-γ誘導的腸上皮屏障

10、損傷
　　本論文試驗2結果表明氧化鋅能夠保護仔豬腸道屏障并激活ERK1/2通路，但關于氧化鋅保護腸道屏障的分子信號機制還未有研究。本試驗利用TNF-α/IFN-γ誘導的體外豬腸上皮屏障損傷模型，研究了氧化鋅對TNF-α/IFN-γ誘導的體外腸上皮屏障功能、緊密連接蛋白表達和分布及ERK1/2信號通路的影響，旨在解析氧化鋅保護腸上皮屏障的分子信號機制。結果表明:1）TNF-α/IFN-γ處理12h后導致腸上皮屏障TER顯著降低和FD

11、4通透性顯著升高(P＜0.05);氧化鋅預處理顯著緩解了TNF-α/IFN-γ誘導的TER降低和FD4升高(P＜0.05)。2)TNF-α/IFN-γ處理顯著降低了腸上皮細胞Occludin、ZO-1和Claudin-1的表達(P＜0.05)，導致Occludin分布紊亂;氧化鋅預處理顯著抑制了TNF-α/IFN-γ引起的緊密連接蛋白表達下降和Occludin分布紊亂(P＜0.05)。3）與TNF-α/IFN-γ處理組相比，氧化鋅預處理

12、顯著提高了ERK1/2通路的激活強度和時間(P＜0.05);阻斷ERK1/2通路顯著抑制了氧化鋅保護腸上皮屏障的作用及對緊密連接蛋白表達和Occludin分布的調控(P＜0.05)。上述結果表明，氧化鋅通過激活ERK1/2信號通路，調控緊密連接蛋白表達和分布，從而緩解了TNF-α/IFN-γ誘導的腸上皮屏障損傷。
　　本論文試驗3結果表明氧化鋅降低了TLR4通路信號分子和NF-κB表達，緩解了腸道炎癥，但關于氧化鋅緩解腸道炎癥的分

13、子信號機制仍不完全清楚。本試驗構建了LPS(1μg/ml)誘導的豬腸上皮細胞炎癥模型，旨在研究氧化鋅緩解腸道炎癥的分子信號機制。結果表明:1）LPS顯著提高了腸上皮細胞TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-8的表達(P＜0.05);而50μM和100μM ZnO預處理顯著抑制了LPS誘導的TLR4和炎癥因子的表達(P＜0.05)。2）LPS顯著降低了IκBα含量(P＜0.05)，提高了p-IκBα含量（P＜0.05）;而ZnO(100

14、μM)預處理顯著抑制了LPS誘導的IκBα升高（P＜0.05）和p-IκBα降低（P＜0.05）。3）LPS顯著降低了胞質中NF-κB的含量(P＜0.05)，提高了胞核中NF-κB的含量(P＜0.05);而ZnO（100μM）預處理顯著抑制了LPS誘導的胞質NF-κB的降低和胞核NF-κB的升高(P＜0.05)。4)LPS提高了NF-κB(p65)入核;而氧化鋅預處理顯著抑制了LPS誘導的NF-κB(p65)的入核。結果提示，氧化鋅通過

15、抑制LPS誘導的IκB磷酸化和NF-κB入核，降低了LPS誘導的腸上皮細胞TLR4受體及炎癥因子的表達，緩解了腸道炎癥。
　　7.氧化鋅對肥大細胞和上皮細胞的互作的影響
　　試驗3結果表明氧化鋅顯著影響了斷奶仔豬空腸肥大細胞的數(shù)量、活性和類型，但關于肥大細胞在氧化鋅保護腸道屏障中的作用仍未見研究報道。本試驗通過構建肥大細胞（LAD2細胞）和上皮細胞（Caco-2細胞）共培養(yǎng)模型，旨在研究氧化鋅對肥大細胞和上皮細胞互作的影響，

16、解析氧化鋅緩解腸上皮炎癥反應的內在機制。結果表明:1）Caco-2與LAD2細胞共培養(yǎng)顯著提高了IL-2、IL-6和IL-8表達和含量(P＜0.05)。2）Caco-2與LAD2細胞共培養(yǎng)，LAD2細胞通過直接接觸和間接作用促進了Caco2細胞IL-2、IL-6和IL-8的分泌(P＜0.05)。3)Caco-2與LAD2細胞共培養(yǎng)激活了MAPKs(ERK、p38MAPK和JNK)和NF-κB通路，阻斷MAPKs和NF-κB通路顯著降低了

17、IL-2、IL-6和IL-8的分泌(P＜0.05)。4）氧化鋅預處理Caco-2細胞顯著降低了共培養(yǎng)誘導的IL-2、IL-6和IL-8的分泌(P＜0.05)。結果提示，氧化鋅通過影響肥大細胞和上皮細胞互作，降低炎癥因子分泌，緩解了腸上皮細胞炎癥反應。
　　綜上所述，日糧添加高劑量氧化鋅改善了斷奶仔豬生長性能，降低了仔豬腹瀉，緩解了斷奶應激。其緩解斷奶應激的作用與其保護腸道屏障密切有關。氧化鋅主要通過激活ERK1/2信號通路促進TG