基于自由基理論的仔豬腸道屏障斷奶應(yīng)激損傷機(jī)理研究.pdf_第1頁(yè)
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1、早期斷奶是集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù),它不僅可以提高母豬的生產(chǎn)力和圈舍的利用率,而且可以減少母體向仔豬傳播疾病的機(jī)率,還能提高仔豬的生產(chǎn)性能和后期的胴體品質(zhì)。而仔豬早期斷奶常造成仔豬進(jìn)食減少、體重下降,腸道絨毛損傷,菌群結(jié)構(gòu)變化,腹瀉,統(tǒng)稱(chēng)為早期斷奶應(yīng)激綜合征。本課題組前期研究表明,仔豬早期斷奶過(guò)程會(huì)引起嚴(yán)重氧化應(yīng)激。屏障功能是腸道的一項(xiàng)重要功能,腸道屏障功能的損傷與諸多疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān),腸道屏障可分為物理屏障、化學(xué)屏障、微生物屏障和免

2、疫屏障。本研究以仔豬斷奶為背景,結(jié)合IPEC-J2為基礎(chǔ)的細(xì)胞模型,研究氧化應(yīng)激對(duì)腸道上皮屏障的影響,探討氧化應(yīng)激通過(guò)損傷腸道上皮屏障造成仔豬斷奶應(yīng)激綜合征的機(jī)制,同時(shí)初步探討了了抗氧化劑硫辛酸(LA)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)及貓須草提取物(OE)對(duì)仔豬上皮屏障的調(diào)控作用。
  本研究主要包括以下內(nèi)容:
  1.以IPEC-J2細(xì)胞為基礎(chǔ)的腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的構(gòu)建
  采用CCK8測(cè)定不同濃度的過(guò)氧化氫及黃嘌呤

3、/黃嘌呤氧化酶(X/XO)對(duì)腸道上皮細(xì)胞活力的影響,結(jié)合熒光探針?lè)y(cè)定胞內(nèi)自由基濃度,確定構(gòu)建IPEC-J2細(xì)胞為基礎(chǔ)的腸道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型最佳方式為:1) H2O2誘導(dǎo):1mM過(guò)氧化氫作用細(xì)胞1h;2)X/XO誘導(dǎo):250μM黃嘌呤(X)及50U/L黃嘌呤氧化酶(XO)共同作用6h。
  2.氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞凋亡
  采用流式細(xì)胞術(shù)及彗星電泳檢測(cè)不同濃度H2O2及X/XO處理對(duì)IPEC-J2細(xì)胞凋亡的影響,并采

4、用熒光定量PCR的方法檢測(cè)了凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明氧化應(yīng)激能通過(guò)死亡受體途徑及線粒體途徑造成腸道上皮細(xì)胞凋亡。
  3.氧化應(yīng)激破壞仔豬腸道上皮屏障功能
  通過(guò)檢測(cè)斷奶仔豬回腸抗氧化指標(biāo)確定了本研究中斷奶仔豬腸道受到氧化應(yīng)激影響。采用傳統(tǒng)比色法測(cè)定了斷奶仔豬腸腔中消化酶的活力并測(cè)定了腸液pH,結(jié)果顯示斷奶應(yīng)激使仔豬消化酶活力下降,pH無(wú)顯著變化。通過(guò)構(gòu)建IPEC-J2單層上皮細(xì)胞模型并結(jié)合仔豬斷奶應(yīng)激模型研究氧化應(yīng)激

5、對(duì)腸道上皮緊密連接的影響,通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)緊密連接蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果表明1mM H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激破壞上皮緊密連接,使跨上皮細(xì)胞電阻(TEER)下降28.46±
  1.40%,緊密連接破壞的機(jī)理可能與氧化應(yīng)激時(shí)緊密連接蛋白ZO-1、Occlaudin及Claudin-1表達(dá)下調(diào)有關(guān)。qRT-PCR法檢測(cè)顯示仔豬斷奶氧化應(yīng)激及H2O2造模均能導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞防御素及溶菌酶基因表達(dá)下調(diào)(p<0.05)。研究表明氧化應(yīng)激

6、能造成腸道上皮物理屏障、化學(xué)屏障及免疫屏障的破壞,其機(jī)理可能與氧化應(yīng)激造成上皮細(xì)胞凋亡和活力下降有關(guān)。
  4.抗氧化劑對(duì)腸道上皮的氧化損傷的調(diào)節(jié)作用
  在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞模型中添加濃度為10μg/ml的LA,810μg/ml NAC或50μg/ml OE,研究抗氧化劑對(duì)氧化應(yīng)激損傷的腸道上皮的保護(hù)作用。結(jié)果顯示,抗氧化劑預(yù)保護(hù)能有效緩解過(guò)氧化氫對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的氧化應(yīng)激影響,清除胞內(nèi)自由基、提高細(xì)胞活

7、力、降低凋亡細(xì)胞數(shù),并上調(diào)緊密連接蛋白及防御素、溶菌酶基因的表達(dá),保護(hù)腸道上皮屏障。
  5.宏基因組分析斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響
  采用Illumina測(cè)序方法對(duì)21日齡斷奶和哺乳仔豬回腸內(nèi)菌群V4區(qū)基因信息進(jìn)行宏基因組測(cè)序分析。結(jié)果顯示,與哺乳仔豬相比,斷奶仔豬回腸中藍(lán)藻門(mén)、及Thermi門(mén)類(lèi)的數(shù)量顯著增多(p<0.05),而廣古菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、無(wú)壁菌門(mén)及TM7門(mén)數(shù)量則顯著減少(p<0.05)。在屬的

8、水平上,針對(duì)能準(zhǔn)確鑒定的屬進(jìn)行分析,斷奶氧化應(yīng)激造成乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬等23個(gè)屬豐度減少,11個(gè)屬豐度增加(部分未鑒定出的屬未列入)。豐度減少的屬中許多是益生菌,斷奶后腸桿菌科菌群數(shù)量顯著增多。
  6.氧化應(yīng)激造成小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響
  采用注射D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠氧化應(yīng)激,變性梯度凝膠電泳(DGGE)檢測(cè)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)變化,并采用熒光定量PCR檢測(cè)腸道中乳酸菌及大腸桿菌的數(shù)量。結(jié)果表明D-半乳糖造模的氧化應(yīng)激使小

9、鼠小腸內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)顯著改變,菌群多樣性增加,乳酸菌數(shù)量顯著下降,大腸桿菌數(shù)量顯著增多??寡趸瘎㎞AC能調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)。
  7.氧化應(yīng)激影響乳酸菌及大腸桿菌相對(duì)數(shù)量改變的機(jī)理研究
  采用傳統(tǒng)比色方法分別測(cè)定植物乳桿菌ACCC11118及產(chǎn)腸毒大腸桿菌C83907的體外抗氧化能力,并測(cè)定不同濃度過(guò)氧化氫對(duì)體外純培養(yǎng)的乳酸菌及大腸桿菌的數(shù)量影響。通過(guò)IPEC-J2細(xì)胞與植物乳桿菌共培養(yǎng)測(cè)定氧化應(yīng)激對(duì)乳酸菌黏附的影響,并采用熒光

10、定量PCR方法測(cè)定了小鼠腸道MUC2、MUC4基因及IPEC-J2細(xì)胞MUC1、MUC4基因的表達(dá)。結(jié)果表明:植物乳桿菌較大腸桿菌有更強(qiáng)的抗氧化能力,氧化應(yīng)激對(duì)混合培養(yǎng)的植物乳桿菌與大腸桿菌數(shù)量比有顯著影響,使大腸桿菌比例相對(duì)下降。氧化應(yīng)激能下調(diào)動(dòng)物腸道上皮粘蛋白基因表達(dá),降低乳酸桿菌對(duì)腸道上皮的黏附。氧化應(yīng)激影響動(dòng)物腸道內(nèi)乳酸菌及大腸桿菌相對(duì)數(shù)量改變的可能機(jī)制為:內(nèi)源性氧化應(yīng)激作用于腸道上皮,誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡,進(jìn)而粘蛋白基因表達(dá)下調(diào),

11、粘蛋白的表達(dá)受到抑制,使得乳酸菌與腸道上皮的黏附受到抑制,數(shù)目相對(duì)減少。而乳酸菌的減少使得乳酸菌的占位效應(yīng)和抑菌素產(chǎn)生減少,對(duì)大腸桿菌的抑制能力減弱,使得大腸桿菌數(shù)目增多。
  由本研究可知,多種因素導(dǎo)致仔豬斷奶期內(nèi)源性自由基增多,造成氧化還原平衡被打破,誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞凋亡,進(jìn)而造成了包括物理屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障、微生物屏障在內(nèi)的腸道上皮屏障破壞,進(jìn)而導(dǎo)致了仔豬斷奶應(yīng)激綜合征的產(chǎn)生。同時(shí),由于豬與人消化道結(jié)構(gòu)與功能的高度相似

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