抗菌肽CWA對斷奶仔豬腸道炎癥和腸道屏障功能的作用及其機制.pdf

1、斷奶造成仔豬腸道功能紊亂，導致腹瀉、生長性能下降甚至死亡，嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展。雖然腹瀉的影響因素較多，但多數研究表明腸道炎癥和腸道屏障功能損傷是斷奶仔豬易發(fā)生腹瀉的主要內在原因。大量抗生素用于防治斷奶仔豬腹瀉，引發(fā)細菌耐藥性、肉產品中藥物殘留及環(huán)境污染等嚴重問題;同時抗生素濫用會損害機體腸道屏障功能，破壞腸道穩(wěn)態(tài)?？咕氖侵匾南忍烀庖叻肿樱蚱鋸V譜抗菌活性、破膜殺菌機制以及不易產生耐藥性等特點而受到關注。最新研究表明，抗菌肽不僅

2、具有免疫調節(jié)作用，還具有腸道上皮屏障保護功能。然而，抗菌肽應用于防治斷奶仔豬腹瀉的效果及其對斷奶仔豬腸道炎癥和腸道上皮屏障功能的作用如何還不得而知。因此，在前期獲得了抗菌活性高、安全性好的抗菌肽CWA的基礎上，本研究開展了抗菌肽CWA對斷奶仔豬腹瀉的防治效果試驗，同時闡明了抗菌肽CWA對腸道炎癥和腸道屏障功能的作用;進一步在小鼠上探究了抗菌肽CWA對細菌感染導致的腸道炎癥和腸道屏障功能損傷的作用;最后體外細胞試驗初步探討了抗菌肽CWA緩

3、解腸道炎癥和保護腸道屏障功能的作用機制。主要研究結果如下:
　　試驗一抗菌肽CWA對斷奶仔豬腸道炎癥和腸道屏障功能的作用
　　(1)抗菌肽CWA對斷奶應激仔豬腸道炎癥的作用
　　選擇18頭健康的杜長大仔豬，21日齡斷奶后分別腹腔注射3次生理鹽水（對照組）和抗菌肽CWA（抗菌肽CWA組），后續(xù)飼養(yǎng)7天，研究抗菌肽CWA對仔豬斷奶應激腹瀉及其腸道炎癥的作用。結果表明，抗菌肽CWA降低了斷奶仔豬腹瀉指數（P＜0.05），提高

4、了斷奶仔豬ADFI(P＜0.05)和ADG(P＜0.05)。同時，抗菌肽CWA降低了血清IgG、TNF-α、IL-6、IL-22含量(P＜0.05)，且提高了血清中TGF-β含量(P＜0.05)。在腸道形態(tài)方面，抗菌肽CWA提高了空腸的絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度比值(P＜0.05)，提高了回腸的絨毛高度/隱窩深度比值(P＜0.05)，降低了回腸的隱窩深度(P＜0.05)。在腸道炎癥方面，抗菌肽CWA降低了腸道中促炎因子的基因表達，其中

5、對空腸的效果最為顯著;同時抗菌肽CWA減少了腸道嗜中性粒細胞和巨噬細胞浸潤;提示抗菌肽CWA能夠緩解斷奶仔豬腸道炎癥。在腸道炎癥信號通路蛋白表達方面，抗菌肽CWA顯著降低空腸組織炎癥信號通路中關鍵蛋白NF-κB、IκB-α的磷酸化水平，提示抗菌肽CWA可能通過下調NF-κB信號通路緩解腸道炎癥。
　　(2)抗菌肽CWA對腹瀉斷奶仔豬腸道炎癥和腸道屏障功能的作用
　　選擇108頭腹瀉的杜長大斷奶仔豬，分別腹腔注射4次生理鹽水（

6、對照組）、恩諾沙星（抗生素組）、抗菌肽CWA（抗菌肽CWA組），研究抗菌肽CWA對腹瀉斷奶仔豬腸道炎癥和腸道屏障功能的作用。結果表明，抗菌肽CWA和抗生素均降低了斷奶仔豬的腹瀉指數（P＜0.05）和腹瀉率（P＜0.05），均提高了斷奶仔豬ADFI（P＜0.05）和ADG(P＜0.05)，且兩者無顯著差異。在腸道形態(tài)方面，抗菌肽CWA和抗生素對小腸絨毛形態(tài)損傷均有緩解作用，其中對空腸的作用最顯著;掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現，抗菌肽CWA和

7、抗生素改善了空腸微絨毛數量與長度，且抗菌肽CWA的改善作用優(yōu)于抗生素。在腸道炎癥方面，抗菌肽CWA組和抗生素組均降低了空腸中促炎因子IL-6、IL-8、IL-22的含量(P＜0.05)，對血清也有類似規(guī)律;同時，抗菌肽CWA和抗生素均緩解了腹瀉斷奶仔豬空腸嗜中性粒細胞浸潤;進一步，抗菌肽CWA組和抗生素組均降低了空腸組織中炎癥相關蛋白NF-κB、IκB-α、AKT的磷酸化水平及上游調控關鍵蛋白TLR4、MyD88的表達;且抗菌肽CWA緩

8、解腸道炎癥的作用與抗生素相當。在腸道上皮屏障功能方面，抗生素組不僅降低了空腸粘液素和防御素的表達，而且降低了空腸中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達（P＜0.05）;然而，抗菌肽CWA卻提高了空腸中ZO-1和Occludin的表達（P＜0.05）;提示抗菌肽CWA可能提高腸道上皮屏障功能而抗生素卻損害腸道上皮屏障功能。在腸道微生物菌群及SCFAs含量方面，與對照組相比，抗菌肽CWA組和抗生素組均降低了糞便中大腸桿菌比例(P＜0

9、.05)，均提高了糞便中乳酸桿菌/大腸桿菌比值(P＜0.05);然而，抗菌肽CWA提高了糞便中乳酸桿菌比例(P＜0.05)，抗生素卻降低了糞便中乳酸桿菌比例(P＜0.05);進一步，抗菌肽CWA提高了糞便中乙酸、丙酸及丁酸的濃度(P＜0.05)，而抗生素降低了糞便中丁酸的濃度、丁酸/乙酸比值及丁酸/丙酸比值(P＜0.05)。
　　試驗二抗菌肽CWA對細菌感染小鼠腸道炎癥和腸道屏障功能的作用
　　在發(fā)現抗菌肽CWA緩解斷奶仔豬

10、腸道炎癥和腸道屏障功能損傷的基礎上，進一步在小鼠上研究抗菌肽CWA對細菌感染引起的腸道炎癥和腸道屏障功能損傷的影響。選擇36只斷奶小鼠分為對照組、E.coli組、E.coli+Enro組、E.coli+CWA組，EHEC O157∶H7感染后分別腹腔注射生理鹽水、恩諾沙星(Enro)、抗菌肽CWA。結果表明，抗菌肽CWA和恩諾沙星均提高了染菌小鼠的存活率，緩解了染菌導致的小鼠體重下降。在腸道形態(tài)方面，抗菌肽CWA和恩諾沙星均緩解了染菌導

11、致的小鼠空腸絨毛萎縮、隱窩增生和結腸粘膜上皮破損、杯狀細胞數量增加。在炎癥方面，E.coli+Enro組和E.coli+CWA組均緩解了染菌導致的小鼠血清和結腸中TNF-α、IL-6、IL-10含量升高(P＜0.05);同時均緩解了染菌導致的小鼠空腸中IL-6含量的升高(P＜0.05);抗菌肽CWA在緩解炎癥方面與恩諾沙星無顯著差異。在腸道抗菌蛋白表達方面，E.coli+Enro組和E.coli+CWA組均緩解了染菌導致的空腸中REG3

12、γ基因表達升高和結腸中Remlβ基因表達升高(P＜0.05)。然而，抗菌肽CWA組了小鼠空腸和結腸中TFF3基因表達水平（P＜0.05）。同時，E.coli+Enro組和E.coli+CWA組均緩解了染菌導致的小鼠空腸中杯狀細胞數量減少、粘液層厚度降低和結腸中杯狀細胞數量增加。進一步，Western blot和免疫熒光的結果表明，E.coli+Enro組和E.coli+CWA組均緩解了染菌導致的小鼠空腸MUC-2表達的降低和結腸MUC-

13、2表達的升高（P＜0.05）。在腸道上皮屏障功能方面，E.coli+CWA組緩解了染菌導致的小鼠空腸中ZO-1和Occludin蛋白表達的下降（P＜0.05），而E.coli+Enro組僅緩解了ZO-1蛋白表達的下降(P＜0.05)，抗菌肽CWA的效果優(yōu)于抗生素。在腸道微生物菌群及SCFAs濃度方面，不同處理小鼠盲腸內容物中總菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌的數量無顯著差異，E.coli+Enro組和E.coli+CWA組均緩解了染菌導致的盲腸中

14、乳酸桿菌數量的降低和大腸桿菌數量的升高（P＜0.05），同時E.coli+CWA組緩解了染菌導致的盲腸中乳酸桿菌/大腸桿菌比值的下降（P＜0.05）。同時，Ecoli+CWA組和E.coli+Enro組均對染菌導致的SCFAs濃度的降低具有一定程度的緩解作用。以上結果進一步證明了抗菌肽CWA能夠緩解腸道炎癥和改善腸道屏障功能，與斷奶仔豬的試驗結果一致。
　　試驗三抗菌肽CWA對腸道炎癥和腸道上皮屏障功能的調控機制
　　(1)

15、抗菌肽CWA緩解腸道炎癥的作用機制
　　利用LPS誘導的豬巨噬細胞炎癥模型發(fā)現，恩諾沙星對LPS導致的炎癥反應無緩解作用，而抗菌肽CWA可以緩解LPS導致的炎癥反應且呈濃度依賴效應。同時，抗菌肽CWA緩解了LPS導致的IL-6、IL-8、IL-22表達升高和NF-κB、IκB-α磷酸化水平升高(P＜0.05)。利用siRNA技術沉默豬巨噬細胞TLR4和MyD88后，抗菌肽CWA緩解炎癥的作用受到抑制。利用FITC標記的葡聚糖和流式

16、細胞檢測技術發(fā)現，抗菌肽CWA可以增強巨噬細胞吞噬FITC-葡聚糖的能力，而使用STAT-1抑制劑后，抗菌肽CWA對巨噬細胞吞噬功能的增強作用受到抑制。以上結果表明，抗菌肽CWA緩解腸道炎癥可能是通過TLR4-MyD88-NF-κB信號通路調控炎癥反應和通過STAT-1途徑增強巨噬細胞吞噬功能等機制發(fā)揮作用。
　　(2)抗菌肽CWA改善腸道上皮屏障功能的作用機制
　　利用Caco-2細胞刮傷模型發(fā)現，抗菌肽CWA提高了刮傷細

17、胞的愈合速度，改善受損腸道上皮細胞的修復功能。利用豬空腸上皮細胞(IPEC-J2)屏障功能損傷模型發(fā)現，抗菌肽CWA緩解了LPS導致的IPEC-J2單層細胞TER值的下降，同時緩解了LPS導致的腸道上皮細胞中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin蛋白表達的下降。單獨添加抗菌肽CWA提高了IPEC-J2細胞中ZO-1和Occludin的表達，而添加Rac1抑制劑NSC23766時，抗菌肽CWA對ZO-1和Occludin的提高作用受到抑制