動物源抗菌肽對腸道免疫及物理屏障的影響及其機制研究.pdf

1、本研究以開發(fā)新型抗生素替代品為目的，從研究動物源抗菌肽對緩解腸道炎癥和改善腸道物理屏障功能的角度出發(fā)，在本課題組前期研究工作的基礎上篩選出兩種抗菌活性強、細胞毒性低的動物源抗菌肽C-BF與pBD2，首先以DSS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎為模型，系統研究了抗菌肽C-BF與pBD2對腸道炎癥的緩解作用及對腸上皮物理屏障功能的改善效果，進一步通過體外試驗研究了抗菌肽緩解腸道炎癥及改善腸道物理屏障的途徑，旨在揭示其發(fā)揮上述功能的分子機制。主要研究結

2、果如下:
　　試驗一、抗菌肽對DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠腸道炎癥影響的研究
　　本試驗通過建立葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的潰瘍性結腸炎小鼠模型，通過表觀癥狀、機體炎癥水平及結腸炎癥水平三個方面研究了抗菌肽C-BF和pBD2對DSS誘導小鼠腸道炎癥的影響:
　　(1) DSS誘導小鼠腸炎模型的建立及抗菌肽對DSS誘導小鼠表觀癥狀的影響:
　　在DSS誘導引發(fā)的潰瘍性結腸炎模型中，注射兩種抗菌肽對小鼠表觀癥狀的改善起

3、著積極作用，為后續(xù)深入的在分子層面開展研究提供了依據;
　　(2)抗菌肽對小鼠全身炎癥水平的影響:在全血中主要免疫細胞比例方面，DSS顯著下調了全血中巨噬細胞和B、T淋巴細胞的比例，在一定程度上對機體先天及后天免疫功能的恢復具有促進作用;DSS顯著提高了血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、 IL-8和IL-10的濃度(p＜0.05)，抗菌肽可通過下調炎性因子的分泌緩解機體炎癥;
　　(3)抗菌肽對小鼠結腸炎癥水平的影響:

4、在結腸炎性細胞浸潤方面，DSS誘導后炎性細胞浸潤程度顯著增加(p＜0.05)，而注射抗菌肽C-BF和pBD2后，顯著改善了結腸組織炎性細胞浸潤狀況(p＜0.05)，說明上述兩種抗菌肽可通過抑制入侵結腸組織炎性細胞的數量減緩腸道炎癥;在小鼠結腸mCRAMP表達豐度方面:DSS處理顯著提高了結腸mCRAMP的表達豐度，而注射抗菌肽C-BF與pBD2后，mCRAMP的表達豐度與DSS組比顯著降低抗菌肽對結腸炎癥水平具有明顯緩解作用;在結腸炎性

5、相關酶活方面:DSS誘導組INOS及COX-2的濃度顯著高于對照組(p＜0.05)，抗菌肽可通過下調炎性相關酶濃度的方式緩解腸道炎癥。
　　試驗二、抗菌肽緩解腸道炎癥的機制研究
　　在試驗一發(fā)現抗菌肽C-BF與pBD2對改善DSS誘導小鼠表觀癥狀及緩解腸道炎癥有一定效果的基礎上，本研究進一步從炎性相關信號通路炎癥水平、巨噬細胞吞噬功能及巨噬細胞極化功能三個方面對其緩解腸道炎癥的機制進行探討:
　　(1)抗菌肽緩解DSS

6、誘導小鼠腸炎的信號通路研究:在緩解腸道炎癥信號通路方面，在DSS誘導下，會引起與炎性因子分泌相關的信號NF-κB(p65)及c-jun的磷酸化水平顯著提高(p＜0.05)，抗菌肽C-BF和pBD2可能是通過抑制NF-κB(p65)而非c-jun的磷酸化水平緩解DSS誘導的小鼠結腸炎癥;在小鼠巨噬細胞炎性因子表達水平方面:抗菌肽C-BF和pBD2均可顯著降低LPS導致的RAW264.7細胞分泌上清中TNF-α、PGE2及NO濃度的異常升高

7、(p＜0.05)，抗菌肽C-BF和pBD2均可顯著降低RAW264.7細胞的炎癥水平;在緩解小鼠巨噬細胞炎癥信號通路方面:抗菌肽C-BF和pBD2可通過抑制NF-κB相關信號通路的磷酸化水平緩解炎癥。
　　在上述研究發(fā)現抗菌肽C-BF和pBD2具有緩解炎癥的功能及其可能的信號通路后，進一步研究了其是否對正常巨噬細胞具有調控功能及其可能的分子機制:
　　(2)抗菌肽對豬巨噬細胞吞噬功能的影響及其機制:在對豬巨噬細胞吞噬功能的影

8、響方面，抗菌肽C-BF和pBD2對豬巨噬細胞的吞噬功能均具有促進作用，其中抗菌肽C-BF具有劑量依賴效應;在促進豬巨噬細胞吞噬功能的機例方面:表明TLR2和TLR4干擾后，抗菌肽C-BF和pBD2對豬巨噬細胞吞噬功能的促進作用明顯減弱，說明上述兩種抗菌肽促進豬巨噬細胞吞噬功能可能是通過TLR2/4信號途徑介導，上述結果提示抗菌肽緩解腸道炎癥的另一機制可能是通過增強巨噬細胞對細菌的吞噬功能，減少感染腸道病原菌數量實現;
　　(3)抗

9、菌肽協同誘導豬巨噬細胞極化分型的作用:在豬巨噬細胞極化分型的影響方面，抗菌肽C-BF和pBD2均可通過激活STAT-6的磷酸化水平協同誘導豬巨噬細胞向M2型分化，同時也發(fā)現其協同誘導后上調了M2型巨噬細胞表面特征分子的基因表達水平，且抗菌肽C-BF的協同誘導效果優(yōu)于抗菌肽pBD2。該結果從影響巨噬細胞分型的角度揭示了抗菌肽C-BF和pBD2緩解炎癥的又一分子機制。
　　試驗三、抗菌肽對DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠腸道物理屏障的保護功

10、能研究
　　本研究從腸道形態(tài)、腸道電生理變化及結腸上皮凋亡與緊密連接蛋白表達三個方面研究了抗菌肽對小鼠腸道物理屏障的保護功能:
　　(1)抗菌肽對DSS致小鼠腸道形態(tài)損傷的影響:在結腸形態(tài)方面，采集小鼠腸道樣品，制作H&E染色切片對結腸形態(tài)進行觀察，從腸道形態(tài)來看，與對照組相比，DSS誘導組小鼠結腸上皮受到嚴重的破壞，腸絨毛結構雜亂無章，且用肉眼已完全無法分辨其腸上皮粘膜層結構，同時粘膜下層水腫嚴重，加入抗菌肽C-BF和pB

11、D2處理組小鼠結腸絨毛結構與DSS組相比發(fā)生明顯改變，腸絨毛間邊界清晰，具有完整的粘膜層形態(tài)結構，且粘膜下層水腫情況有了明顯改善;結果提示抗菌肽可明顯改善DSS導致的結腸上皮形態(tài)破壞;
　　(2)抗菌肽對DSS誘導小鼠結腸電生理學變化的影響:與正常對照組比較，DSS誘導組小鼠血清中FITC-dextran濃度顯著提高(p＜0.05)，而注射C-BF后血清中FITC-dextran濃度與DSS組比較顯著下調(p＜0.05)，注射pB

12、D2后血清中FITC-dextran濃度有下降的趨勢，上述結果提示抗菌肽在不同程度上降低了DSS致結腸通透性增加;在結腸垮上皮電阻值方面:通過Ussing champer測定各組結腸粘膜跨上皮電阻值變化，結果表明DSS誘導組小鼠跨上皮電阻值明顯低于40Ω，而不同抗菌肽處理組小鼠跨上皮膜電阻值均穩(wěn)定在40Ω以上，結果提示抗菌肽對于維持結腸電生理學的穩(wěn)定狀態(tài)具有積極作用;
　　(3)抗菌肽對結腸上度細胞凋亡及緊密連接蛋白表達的影響:D

13、SS誘導的小鼠其結腸上皮細胞凋亡指數顯著增加(p＜0.05)，而在DSS的誘導過程中，加入抗菌肽C-BF和pBD2處理的組別，其結腸上皮細胞凋亡指數與單獨用DSS誘導組相比顯著降低(p＜0.05)，結果說明抑制結腸上皮凋亡水平可能是緩解跨上皮電阻值下降，維持腸道形態(tài)正常的原因之一;在緊密連接蛋白及黏蛋白表達方面:通過qRT-PCR檢測各組結腸組織緊密連接蛋白及黏蛋白的基因表達水平，結果表明:與對照組相比，DSS處理組顯著降低了緊密連接蛋

14、白和黏蛋白的表達水平(p＜0.05)，而加入抗菌肽處理的組別，提高了緊密連接蛋白的表達水平，其中抗菌肽C-BF的促進效果優(yōu)于pBD2。上述研究結果提示抗菌肽可通過改善緊密連接蛋白的表達，維持腸道物理屏障功能正常。
　　試驗四、抗菌肽保護腸道物理屏障的機制研究
　　在上述研究發(fā)現抗菌肽C-BF與pBD2對改善腸道物理屏障具有明顯效果的基礎上，本研究從腸細胞單層跨上皮電阻值、細胞間緊密連接結構及腸細胞形態(tài)三個方面對其保護腸道物理

15、屏障的機制進行探討:
　　(1)抗菌肽對DSS致腸上皮細胞單層跨膜電阻值降低的影響:在Caco-2細胞單層跨膜電阻值方面，本研究模擬體內腸上皮組織結構特點，體外培養(yǎng)人Caco-2細胞至單層分化狀態(tài)，用DSS進行細胞模型的建立，研究結果表明DSS單獨處理組Caco-2細胞單層跨上皮電阻值顯著低于對照組(p＜0.05)，而抗菌肽C-BF和pBD2預處理的組別，其跨上皮電阻值與對照組接近;
　　(2)抗菌肽對Caco-2細胞間緊密

16、連接結構及緊密連接蛋白表達的影響:在Caco-2細胞間緊密連接結構方面，通過透射電鏡對培養(yǎng)的Caco-2細胞單層緊密連接結構進行觀察，研究結果表明DSS可使本來結構完整清晰的緊密連接結構被破壞，而用抗菌肽C-BF和pBD2預處理的組別，其緊密連接結構完整，說明維持緊密連接結構的完整性是抗菌肽緩解DSS致跨上皮電阻值降低的機制之一;在緊密連接蛋白的表達方面:通過western-blot和qRT-PCR分析抗菌肽對DSS致緊密連接蛋白表達下

17、調的影響，結果表明與正常對照組比較，DSS處理組ZO-1、Claudin-1、Occludin的表達水平均顯著低于對照組(p＜0.05)，而加入抗菌肽預處理后，上述三個緊密連接蛋白的表達水平均有不同程度升高，提示抗菌肽可促進緊密連接蛋白的表達維持緊密連接結構完整性;
　　(3)抗菌肽對單個上皮細胞形態(tài)的影響:在單個Caco-2細胞形態(tài)方面，通過掃描電鏡觀察抗菌肽對DSS致單個Caco-2細胞形態(tài)破壞的影響，結果表明DSS處理組Ca

18、co-2細胞表面微絨毛形態(tài)受到嚴重破壞，呈光滑狀，從多細胞視野中甚至可以看到一些細胞已經發(fā)生瓦解或呈現碎片樣，而在DSS刺激前加入抗菌肽C-BF和pBD2預處理的各組，其Caco-2細胞表面徽絨毛形態(tài)與對照組接近，提示抗菌肽對單個上皮細胞的正常生長同樣具有保護作用。
　　綜上所述，本研究通過DSS誘導小鼠潰瘍性結腸炎模型發(fā)現抗菌肽C-BF和pBD2具有顯著緩解腸道炎癥和改善腸道物理屏障的功能，并揭示了其緩解炎癥和改善屏障功能的內在