2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、研究背景和目的: 鼻咽癌(NasoPharyngeal Carcinoma,NPC)是一種主要發(fā)生在我國(guó)南方地區(qū)的鼻咽部惡性腫瘤,由于NPC發(fā)生的部位比較隱蔽,早期癥狀常不明顯而容易被忽略,因此確診的患者60%以上都是中、晚期病例,常伴有轉(zhuǎn)移發(fā)生。尋找鼻咽癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的機(jī)制,是我們當(dāng)前研究的主要方向。 腫瘤的形成和侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多階段、多因子參與的復(fù)雜而又連續(xù)的過程,涉及了一些關(guān)鍵的癌基因和抑癌基因。在前期研

2、究中,我們利用cDNA微陣列檢測(cè)了鼻咽癌組織、混合的鼻咽癌細(xì)胞(5-8F、6-10B和CNE2)與非癌鼻咽組織間的差異表達(dá)基因,經(jīng)BRB軟件分析,真核翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factors,EIFs)EIF4G1在鼻咽癌組織和細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào),提示該基因可能正向參與促進(jìn)了鼻咽癌的發(fā)病過程。 EIF4G1作為一個(gè)“支架蛋白”,使其它與翻譯起始有關(guān)的因子與之結(jié)合而發(fā)揮各自

3、的作用。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)表明,EIF4G1除了促進(jìn)蛋白翻譯外,也與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)。該基因有報(bào)導(dǎo)在喉癌、肺癌、乳腺癌中表達(dá)明顯增高,促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞蛋白翻譯、腫瘤血管生成、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和抗凋亡。 為了闡明/EIF4G1基因在鼻咽癌發(fā)病中的作用,我們利用RNAi技術(shù)高效、特異的靶向沉默機(jī)制干擾鼻咽癌細(xì)胞5-8F中EIF4G1表達(dá),建立穩(wěn)定靶向干擾EIF4G1表達(dá)的siRNA鼻咽癌細(xì)胞,以觀察干擾EIF4G1后,鼻咽癌

4、生物學(xué)功能改變,為鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制和治療提供新的思路。 方法: 1. EIF4G1在鼻咽癌中的表達(dá)特性鑒定。 免疫組化SP法從蛋白水平檢測(cè)EIF4G1在非癌鼻咽炎組織和鼻咽癌中的表達(dá)水平,初步探討EIF4G1在組織水平與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 熒光定量PCR法從mRNA水平檢測(cè)EIF4G1在永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69和鼻咽癌細(xì)胞5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、

5、SUNE1中的表達(dá)水平,初步探討EIF4G1在永生化鼻咽上皮細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)差異,并找到高表達(dá)EIF4G1的鼻咽癌細(xì)胞作為下一步干擾對(duì)象。 2.EIF4G1表達(dá)沉默對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)影響。 構(gòu)建EIF4G1慢病毒干擾、陰性對(duì)照載體,包裝成成熟的慢病毒顆粒感染高表達(dá)EIF4G1的5-8F細(xì)胞,篩選出穩(wěn)定的陽(yáng)性和空載克隆,熒光定量PCR檢測(cè)各干擾克隆細(xì)胞中EIF4G1干擾效率,篩選干擾效率最高的細(xì)胞克隆。在weste

6、rn-blot驗(yàn)證干擾后EIF4G1蛋白表達(dá)水平后,該細(xì)胞克隆作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象被進(jìn)一步研究。MTT法、流式細(xì)胞術(shù)及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EIF4G1沉默后對(duì)細(xì)胞體外增殖的影響;Transwell和boyden小室分別檢測(cè)EIF4G1沉默后細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)和侵襲能力的改變;裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)來觀察EIF4G1沉默后裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,第一章中因免疫組化各指標(biāo)均為等

7、級(jí)資料,故其組間的比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn),EIF4G1的表達(dá)在非癌鼻咽組織和鼻咽癌比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);EIF4G1的表達(dá)與鼻咽癌病理分化的關(guān)系檢驗(yàn)用Kruskal Wallis Test,檢驗(yàn)水準(zhǔn)均取雙側(cè)α=0.05;熒光定量PCR法檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞株EIF4G1表達(dá)特性結(jié)果比較采用單因素方差分析,多重比較采用SNK檢驗(yàn)。第二章中熒光定量PCR、運(yùn)動(dòng)、侵襲實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期采用單因素方差分析;MTT采用

8、析因設(shè)計(jì)的方差分析;多重比較采用SNK或LSD檢驗(yàn);裸鼠皮下移植瘤采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。 結(jié)果: 1、EIF4G1在鼻咽癌中的表達(dá)特性鑒定。 1)共收集鼻咽炎組16例、鼻咽癌組40例臨床標(biāo)本。SP免疫組化結(jié)果表明,EIF4G1表達(dá)主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。EIF4G1在鼻咽癌和非癌鼻咽炎組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.971,P=0.000),EIF4G1的表達(dá)情況與臨床病理分化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=2.5

9、08,P=0.285)。 2)熒光定量PCR法檢測(cè)EIF4G1在永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69和鼻咽癌細(xì)胞5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1 mRNA水平表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.575,P=0.000),5-8F表達(dá)最高,表達(dá)量為NP69 EIF4G1表達(dá)量的19.5倍,作為下一步干擾對(duì)象。 2、EIF4G1表達(dá)沉默對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)影響。 1)構(gòu)建慢病毒

10、干擾載體和陰性對(duì)照載體,包裝慢病毒后感染5-8F細(xì)胞,殺稻瘟菌素篩選抗性克隆,熒光定量PCR檢測(cè)各克隆的EIF4G1表達(dá)情況,篩選出干擾效率最高的克?。?9%)為下一步實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象,Western blot驗(yàn)證干擾后蛋白表達(dá)效率。陽(yáng)性克隆的干擾效率與5-8F和陰性對(duì)照細(xì)胞表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.897,P=0.000),同時(shí)檢測(cè)EIF4G1在陰性對(duì)照中的表達(dá)相對(duì)于5-8F強(qiáng)度較一致(1.009±0.066)。陽(yáng)性干擾克隆命名為

11、5-8F/pshRNA-EIF4G1-,陰性對(duì)照克隆為5-8F/pshRNA。 2)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,與陰性對(duì)照5-8F/pshRNA和5-8F細(xì)胞相比,干擾克隆細(xì)胞5-8F/pshRNA-EIF4G1-的增殖速度明顯減慢并且呈時(shí)間依賴關(guān)系,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=131.448,P=0.000);western-blot結(jié)果顯示5-8F/pshRNA-EIF4G1-細(xì)胞EIF4G1表達(dá)下調(diào)80.1%;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也表明各組

12、細(xì)胞中S期和G2/M期變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=22.426,P=0.002和F=7.354,P=0.024),EIF4G1干擾后影響細(xì)胞的細(xì)胞周期正常移行,阻止S期細(xì)胞進(jìn)入G2/M期,造成5-8F/pshRNA-EIF4G1-S期細(xì)胞聚集,G2/M期細(xì)胞減少;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示三組細(xì)胞的克隆形成率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=54.615,P=0.000),5-8F/pshRNA-EIF4G1-細(xì)胞克隆形成減少,5-8F和陰性對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)

13、學(xué)意義(P=0.732)。綜合表明EIF4G1表達(dá)干擾后,5-8F細(xì)胞體外生長(zhǎng)被顯著抑制。 3)Transwell小室檢測(cè)結(jié)果顯示,與5-8F和5-8F/pshRNA細(xì)胞相比,5-8F/pshRNA-EIF4G1-細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)減少,差異具有顯著性(F=38.329,P=0.000);Boyden小室檢測(cè)結(jié)果顯示三組細(xì)胞的的侵襲能力具有顯著性差異(F=6.170,P=0.014),5-8F/pshRNA-EIF4G1

14、-細(xì)胞的侵襲能力顯著降低,說明EIF4G1表達(dá)沉默降低了5-8F細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。 4)將5-8F/pshRNA-EIF4G1-和5-8F/pshRNA細(xì)胞分別對(duì)稱接種于裸鼠上肢腋窩和下肢腹股溝,21天后解剖取瘤塊并稱重,上、下肢成瘤的5-8F/pshRNA和5-8F/pshRNA-EIF4G1-細(xì)胞移植瘤重量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032,P=0.041),表明干擾EIF4G1對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生影響;移植瘤免疫組

15、化結(jié)果表明,EIF4G1在干擾組中的表達(dá)明顯下調(diào),提示干擾克隆在體內(nèi)成瘤后EIF4G1仍維持于低表達(dá)的狀態(tài)。 結(jié)論: 1、免疫組化SP法證實(shí)EIF4G1的表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系。 2、熒光定量PCR法檢測(cè)EIF4G1在永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69和鼻咽癌細(xì)胞5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1中的表達(dá)有差異,5-8F表達(dá)最高。 3、利用慢病毒載體和R

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