AGO2與L1-ORF1p在LINE-1負(fù)反饋調(diào)控中的作用機(jī)制研究.pdf

1、在真核生物基因組中存在許多重復(fù)序列，其中大多是非編碼序列。非編碼序列對編碼基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后等過程具有重要的調(diào)控作用，移動元件作為其重要組成部分和生物的進(jìn)化程度呈正相關(guān)。此外，這些移動元件的活化可影響相鄰基因的表達(dá)，例如在編碼區(qū)內(nèi)或臨近位置的插入能引起基因突變，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的變化和基因組的重塑。Long interspersed element1(LINE-1，L1)作為移動元件中唯一一種自主活性的逆轉(zhuǎn)座子，研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤細(xì)

2、胞普遍激活，在正常分化的細(xì)胞中則處于沉默狀態(tài)，它的非正常激活對細(xì)胞的增殖分化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用，提示其涉及到腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。
　　全長的L1基因有兩個(gè)開放閱讀框ORF1和ORF2，能編碼兩種蛋白L1-ORF1p和L1-ORF2p;其中L1-ORF1p能與自身核酸結(jié)合形成核酸蛋白復(fù)合物(ribonucleoprotein，RNP)，而L1-ORF2p具有內(nèi)切核酸酶及外切酶活性，可與L1-ORF1p一起執(zhí)行逆轉(zhuǎn)座功

3、能。課題組前期研究顯示，L1-ORF1p在細(xì)胞增殖調(diào)控以及腫瘤形成過程中具有重要作用。另外L1的5'UTR包含正義與反義的雙向啟動子，它們的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能生成雙鏈RNA(dsRNA)，繼而生成siRNA，報(bào)道顯示第一個(gè)endo-siRNA就來源于L1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
　　在dsRNA參與的調(diào)控中，RISC(RNA Inducing Silence Complex)的形成是一個(gè)重要的步驟，而RISC組分之一的Argonaute被認(rèn)為是關(guān)鍵的

4、蛋白分子。Argonaute(AGO)蛋白是一種比較保守的堿性蛋白，分子量大小在100 kd左右。在人類的AGO蛋白家族中，有四種蛋白，分別是AGO1、AGO2、AGO3和AGO4。AGO2是唯一一種具有RNA酶活性的家族成員，它能與siRNA結(jié)合形成RISC復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)對靶基因的調(diào)控。鑒于L1-5'UTR的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能生成dsRNA，我們認(rèn)為AGO2可能參與對L1-5'UTR啟動子活性的調(diào)控。此外，報(bào)道顯示L1-ORF1p與RISC具有

5、共定位現(xiàn)象，我們推測L1-ORF1p有可能與AGO2一起參與了L1的負(fù)反饋調(diào)控。所以我們將AGO2和L1-ORF1p作為目標(biāo)蛋白研究其調(diào)控機(jī)制。
　　首先我們研究了L1-ORF1p蛋白與AGO家族蛋白的相互作用，結(jié)果顯示L1-ORF1p與AGO1/AGO2/AGO4具有相互作用，而與AGO3沒有作用。為探索L1-5'UTR的啟動子活性以及dsRNA對其反饋調(diào)控的作用，我們利用熒光素酶表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了含有全長L1-5'UTR(含有雙

6、向啟動子，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能形成dsRNA)以及3'端序列截短的突變體（保留680 bp的L1-5'UTR，基本刪除反義鏈啟動子序列;保留400 bp的L1-5'UTR，完全刪除反義鏈啟動子序列）的重組表達(dá)載體，通過RNAi干涉下調(diào)AGO2的表達(dá)，觀察L1-5'UTR啟動子活性的變化。結(jié)果顯示，AGO2的下調(diào)能增強(qiáng)全長L1-5'UTR的啟動子活性，而對分別含有680 bp和400 bp的L1-5'UTR啟動子活性沒有明顯的影響，鑒于全長L1-

7、5'UTR可生成dsRNA（進(jìn)一步加工生成siRNA），提示LINE-1的負(fù)反饋機(jī)制是由雙向啟動子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所生成的siRNA介導(dǎo)的，AGO2在此過程中起著重要的作用。
　　為探索L1-ORF1p是否參與L1的負(fù)反饋調(diào)控，我們通過過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，觀察其對含有L1-5'UTR全長以及3'端截短的不同突變體活性的影響。結(jié)果顯示，L1-5'UTR無論是全長還是不同截短的突變體，L1-ORF1p對其啟動子活性均具有抑制作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，AG

8、O2的下調(diào)并不能減弱L1-ORF1p對L1-5'UTR啟動子活性的抑制作用，提示L1-ORF1p盡管能與AGO2發(fā)生相互作用，但L1-ORF1p參與對自身表達(dá)的負(fù)反饋調(diào)控不是通過siRNA介導(dǎo)的，其作用機(jī)制需要進(jìn)一步的探索。
　　鑒于L1在腫瘤細(xì)胞中被激活，在正常細(xì)胞中則沉默，其自身存在的反饋抑制對維持細(xì)胞正?；钚跃哂兄匾饬x。本文初步探索了腫瘤發(fā)生過程中L1的作用機(jī)制及其遺傳學(xué)基礎(chǔ)，期望為新型腫瘤靶向藥物的開發(fā)提供新的靶點(diǎn)。