HCN1在調(diào)控胃腸運(yùn)動機(jī)制中的作用.pdf

1、胃腸運(yùn)動受到腦-腸軸的影響。腦-腸軸由中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）、自主神經(jīng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)組成，參與調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動。胃腸平滑肌細(xì)胞（SMC）存在著節(jié)律性收縮，其特征是慢波（SW）。研究表明，ICCs（Cajal間質(zhì)細(xì)胞）是平滑肌慢波活動的起搏細(xì)胞，ICCs根據(jù)其所在位置不同分為4種，其中位于環(huán)形肌和縱形肌之間的肌層間ICC（IC-MY）被證實(shí)是胃腸道產(chǎn)生節(jié)律性慢波的起搏細(xì)胞。抑制性自主神經(jīng)釋放抑制性神經(jīng)遞質(zhì)后，ICCs存在的一氧化氮合成

2、酶（NOS）釋放NO，產(chǎn)生胃腸道運(yùn)動的抑制作用。哺乳動物獨(dú)具的離子通道--超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道(HCN)具有內(nèi)在的超激化激活電流（Ih）活性，已證實(shí)HCN為慢波起搏通道，并且心臟起搏和神經(jīng)活動依賴HCN的活性。HCN分為4個亞型，關(guān)于HCN1在胃腸的分布以及運(yùn)動方面的研究尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)室前期采用了超微結(jié)構(gòu)、免疫熒光雙標(biāo)方法，發(fā)現(xiàn)大鼠胃腸道ICCs上有自律性節(jié)律產(chǎn)生離子通道--超極化激活性環(huán)核苷酸門控陽離子通道HCN1的特

3、異分布；采用蛋白胚胎發(fā)育表達(dá)方法觀察到，在大鼠胃腸道產(chǎn)生穩(wěn)定胃腸蠕動的關(guān)鍵時期表達(dá)升高，預(yù)示HCN1在ICC產(chǎn)生自發(fā)節(jié)律電活動中的可能存在重要意義；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用胃腸離體肌條，在給予HCN1特異性阻斷劑ZD7288阻斷HCN1的功能后，離體肌條的收縮顯著降低。故此證明，HCN1可能是胃腸動力起搏的始發(fā)離子通道。臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，胃腸道缺血性改變可以明顯造成患者胃腸動力障礙，那么其產(chǎn)生的機(jī)制是否與HCN1存在關(guān)系，目前未見明確報道。

4、基于此，本研究通過建立大鼠胃腸道缺血模型，采用雙重免疫熒光標(biāo)記方法，分別觀察實(shí)驗(yàn)組及正常參照組大鼠HCN1在胃腸道的表達(dá)變化以及與胃腸道運(yùn)動相關(guān)遞質(zhì)的共存情況，并采用通道阻斷技術(shù)進(jìn)一步觀察HCN1在胃腸道缺血性改變過程中的作用和可能的機(jī)制，為治療胃腸動力障礙疾病提供理論基礎(chǔ)。
　　方法
　?、俳⑿∧c缺血的動物模型；②采用電生理學(xué)的方法，檢測模型大鼠的胃電以及小腸MMC的變化；③根據(jù)動物模型建立的時間，找出胃電和小腸MMC變

5、化的情況的規(guī)律。采用免疫熒光技術(shù)，同步觀察不同時段的模型動物的小腸HCN1的變化情況，從中篩選出變化的典型時段，并對HCN1的表達(dá)與小腸MMC的變化做相關(guān)性分析；④以缺血動物模型小腸動力變化的典型時段為基點(diǎn)，采用阻斷技術(shù)，給予HCN1的特異性阻斷劑ZD7288干預(yù)后，觀察缺血改變小腸的MMC的變化情況，進(jìn)一步驗(yàn)證HCN1的―始發(fā)‖離子通道的作用；⑤采用免疫熒光技術(shù)，對典型時段的小腸組織分別進(jìn)行HCN1與SP、CGRP免疫熒光雙標(biāo)記，從而

6、驗(yàn)證HCN1與某些腦腸肽在胃腸道缺血改變中存在著遞質(zhì)共存。⑥對典型時段的模型動物給予抑制性遞質(zhì)NO的干預(yù)，分別觀察SP、CGRP的表達(dá)以及組織和血漿中其水平的變化以及小腸MMC的變化。
　　結(jié)果
　　1.胃腸道缺血性改變可以導(dǎo)致胃腸動力的變化。在不完全缺血的條件下，在缺血改變的初期胃腸動力處于紊亂和減低的狀況，隨著缺血時間延長，胃腸道的動力逐漸改善。在本研究中我們觀察到，在小腸缺血的初期，胃電和小腸MMC均產(chǎn)生降低，并處于紊

7、亂狀態(tài)。而到缺血性改變的第5天，胃電和小腸MMC均逐漸趨于平穩(wěn)狀態(tài)；到第7天，胃電和小腸MMC與正常組相接近。MMC與c-kit和HCN1的表達(dá)的相關(guān)性分析顯示：隨著胃腸道缺血性改變的時間的延長，c-kit和HCN1的表達(dá)狀況呈現(xiàn)線性正相關(guān)關(guān)系，提示胃腸道缺血性改變可導(dǎo)致胃腸動力變化，胃腸道動力可隨著c-kit和HCN1的逐漸恢復(fù)而使因胃腸道缺血所導(dǎo)致的胃腸道動力障礙得到改善。
　　2．HCN1存在于在胃腸黏膜和平滑肌間隙中,與c

8、-kit雙標(biāo)記陽性，在胃腸道缺血狀況下表達(dá)明顯增高。當(dāng)HCN1的功能被阻斷，因缺血性改變而導(dǎo)致的胃腸道動力改變可因HCN1的動力起搏作用被阻斷而顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了HCN1的始發(fā)離子通道的作用。并且HCN1與調(diào)節(jié)胃腸動力相關(guān)的腦腸肽SP和CGRP存在遞質(zhì)共存，這種共存關(guān)系不因HCN1的功能阻斷而產(chǎn)生影響。故此，進(jìn)一步提示，SP和CGRP可能在HCN的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。
　　3.當(dāng)給予外源性抑制胃腸動力的腦腸肽NO進(jìn)行干預(yù)后，H

9、CN1的表達(dá)以及SP、CGRP水平均降低，由此提示，離子通道HCN1是受到興奮性遞質(zhì)和抑制性遞質(zhì)的共同作用來調(diào)節(jié)其發(fā)揮―始發(fā)‖離子通道的作用，而且，當(dāng)抑制性遞質(zhì)作用增強(qiáng)的情況下，胃腸運(yùn)動將受到明顯抑制。
　　結(jié)論
　　HCN1存在于胃腸黏膜及平滑肌間隙，在腸缺血后，隨著側(cè)枝循環(huán)的不斷建立，胃腸動力的起搏起始通道HCN1的活性表達(dá)升高，同時神經(jīng)遞質(zhì)SP、CGRP也表達(dá)于小腸肌間神經(jīng)叢并代償性增高，在抑制性遞質(zhì)NO作用后上述指標(biāo)