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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景
c-Myc及E2F1相關(guān)信號(hào)途徑是決定細(xì)胞命運(yùn)的核心機(jī)制之一,研究已證實(shí)hTERT是二者共同的下游靶基因,不同的是:c-Myc誘導(dǎo)hTERT表達(dá),而E2F1則抑制hTERT的表達(dá)。由于E2F1也受c-Myc正性調(diào)節(jié),因此,我們推測(cè):在正常細(xì)胞中,E2F1可能對(duì)c-Myc-hTERT信號(hào)途徑存在著負(fù)反饋調(diào)控,從而在一定程度上抑制了腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性。
研究方法
本項(xiàng)目擬針對(duì)上述假設(shè),以人胚胎成纖維細(xì)胞
2、為模型,采用基因轉(zhuǎn)染、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、CHIP、CHIP-re-CHIP等技術(shù)證實(shí)E2F1對(duì)c-Myc誘導(dǎo)hTERT表達(dá)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。
研究結(jié)果
1)c-Myc活化對(duì)人胚胎成纖維細(xì)胞hTERT和E2F1表達(dá)及下游信號(hào)通路的影響
以 Ad-c-Myc重組腺病毒感染人胚胎成纖維細(xì)胞,qRT-PCR及 Western blot檢測(cè)c-Myc活化對(duì)E2F1和hTERT mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯
3、示,E2F1和hTERT的表達(dá)在 c-Myc激活的情況下均會(huì)出現(xiàn)增加,二者區(qū)別在于,前者的表達(dá)水平是在c-Myc高度激活時(shí)才出現(xiàn)明顯增加,而后者的表達(dá)水平則可在c-Myc低度激活時(shí)就開始增加,而且c-Myc激活的程度越高,hTERT的表達(dá)水平增加越多,其表達(dá)水平的增加與c-Myc激活的程度是一致的。進(jìn)一步,我們探討了c-Myc活化對(duì)E2F1和hTERT下游信號(hào)通路的影響,結(jié)果顯示,在c-Myc中低度時(shí),端粒酶活性逐漸升高,而細(xì)胞凋亡的比
4、率并沒有明顯改變;在 c-Myc被高度激活的情況下,E2F1的蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)明顯升高,這也就能夠增加細(xì)胞凋亡的比率。隨后對(duì)E2F1加以抑制,我們發(fā)現(xiàn):在c-Myc中低度激活時(shí)抑制E2F1表達(dá),可致hTERT活化水平上升;而在c-Myc受到高度激活的同時(shí)對(duì) E2F1的表達(dá)加以抑制,則能夠避免細(xì)胞凋亡,且細(xì)胞端粒酶的活性會(huì)出現(xiàn)有進(jìn)一步的升高。以上這些結(jié)果顯示:E2F1對(duì)c-Myc誘導(dǎo)hTERT表達(dá)是存在著負(fù)反饋調(diào)控作用的。
2)
5、E2F1通過與hTERT啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合對(duì)c-Myc誘導(dǎo)hTERT表達(dá)進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)控我們首先應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí),在人胚胎成纖維細(xì)胞中 E2F1能夠抑制 hTERT基因表達(dá),這個(gè)過程是可以通過 E2F1與 hTERT啟動(dòng)子的結(jié)合而得以實(shí)現(xiàn)的;隨后應(yīng)用 CHIP實(shí)驗(yàn)(anti-E2F1)進(jìn)一步驗(yàn)證 E2F1可與 hTERT啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合;CHIP-re-CHIP實(shí)驗(yàn)(anti-E2F1和anti-c-Myc)則顯示c-Myc活
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