MiR-494通過轉(zhuǎn)錄因子E2F1調(diào)控肺癌細(xì)胞周期的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建miR-494慢病毒表達(dá)載體及探討miR-494對(duì)肺癌細(xì)胞株的增殖、侵襲、遷移等功能研究以及與E2F1的調(diào)控關(guān)系。
　　 方法：⑴根據(jù)GenBank提供的miR-494基因的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)含有BamH/XhoⅠ酶切位點(diǎn)特異性引物，用PCR法擴(kuò)增目的基因的片段，目的基因同源重組入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli.DH5α中擴(kuò)增，挑取平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定，接種陽性克隆并進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序沒有問題的，再接

2、種抽提質(zhì)粒。之后分別用三種質(zhì)粒（重組質(zhì)粒:pNL-EGFP/CMV/WPREdU3;包裝質(zhì)粒:pCD/NL-BH*DDD;膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒: pLTR-G）進(jìn)行慢病毒的包裝。命名為:pGIPZ-miR-494-eGFP，空載的命名為:pGIPZ-eGFP。并進(jìn)行慢病毒的濃縮及純化，最后進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定。將慢病毒顆粒感染A549細(xì)胞，并將實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞分為三個(gè)組，帶有目的基因的miR-494組，帶有空載病毒的NC組，和不感染病毒的CON組，將

3、3組細(xì)胞進(jìn)行提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以各組cDNA為模板，利用兩步法進(jìn)行Real-Time PCR來檢測(cè)感染的效率。⑵運(yùn)用細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)了解細(xì)胞增殖的能力，運(yùn)用transwell了解細(xì)胞的遷移能力。⑶通過染色質(zhì)免疫共沉淀(chip)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩者間是否存在調(diào)控關(guān)系。
　　 結(jié)果：①目的基因與慢病毒載體連接成功。共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝病毒與濃縮后滴度達(dá)1.02*108TU/ml，并轉(zhuǎn)染到肺腺癌細(xì)胞株A549上，利用

4、流式細(xì)胞儀分選出的綠色熒光細(xì)胞，通過Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-494慢病毒表達(dá)載體感染的A549細(xì)胞高于對(duì)照組達(dá)10倍以上。②細(xì)胞平板克隆結(jié)果顯示:干擾的細(xì)胞克隆形成能力較空載對(duì)照單克隆細(xì)胞弱，表明miR-494過表達(dá)的A549細(xì)胞體外增殖能力減弱。和空白對(duì)照與空載細(xì)胞在克隆形成率[58.00％±4.96）和（60.50％±5.35）]相比，干擾的A549細(xì)胞的克隆形成率明顯減少（28.00％±3.62）。差異有統(tǒng)計(jì)

5、學(xué)意義(P＜0.05)。③Transwel小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:三組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的差異具有顯著性。與未干擾的A549細(xì)胞和空載細(xì)胞相比，干擾的A549細(xì)胞穿過膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少，其運(yùn)動(dòng)能力明顯降低（138.3±10.41 vs133.3±5.77 vs77.3±3.06;P＜0.05）。④Chip實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在A549細(xì)胞中，E2F1通過與預(yù)測(cè)的四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)從而調(diào)控mir-494的啟動(dòng)子區(qū)，從而對(duì)mir-494進(jìn)行調(diào)控。
　　 結(jié)