AhR-E2F1-KGFR信號(hào)通路參與KGF誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells，IEC)和腸上皮間淋巴細(xì)胞(intraepitheliallymphocytes，IELs)之間的相互作用在腸上皮的生長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)和功能維持方面發(fā)揮著重要作用。角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocyte growth factor,KGF)屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員，在腸道組織中由黏膜層的γδ上皮間淋巴細(xì)胞(γδ intraepithelial lympho

2、cytes，γδ-IELs）分泌產(chǎn)生，與膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(keratinocyte growth factor receptor，KGFR)結(jié)合后以旁分泌的形式促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。我們之前曾經(jīng)報(bào)道過(guò)，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，給小鼠腹腔注射外源性的KGF后，KGF可以通過(guò)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖來(lái)緩解小腸缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)帶來(lái)的損傷以及輻射誘導(dǎo)的腸道損傷，從而起到保護(hù)腸道的作用。研究還表明，在胃腸

3、道中KGFR的表達(dá)量非常豐富，這些發(fā)現(xiàn)提示消化道不僅可以合成、分泌KGF，而且可以對(duì)KGF產(chǎn)生反應(yīng)。
　　最近有學(xué)者使用斑馬魚(yú)模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)在KGF誘導(dǎo)的組織再生中具有重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在鼠科動(dòng)物的3T3成纖維細(xì)胞中，AhR的表達(dá)可以受到成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員(fibroblast growth factor,FGF)的調(diào)控。這些研究都提示我們

4、，內(nèi)源性的AhR可能參與到了FGF介導(dǎo)的信號(hào)通路中，從而在細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)、增殖中發(fā)揮作用。
　　AhR作為一種DNA結(jié)合蛋白，由805個(gè)氨基酸構(gòu)成，屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basichelix-loop-helix，bHLH)超家族，在人體多種器官和組織、細(xì)胞中都有表達(dá)。非配體化的AhR在胞漿中可以和熱休克蛋白90(heat shock protein，HSP90)結(jié)合形成一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合體，當(dāng)AhR被其內(nèi)源性或外源性配體激活后遂

5、與HSP90分離，AhR-配體復(fù)合體轉(zhuǎn)移到核內(nèi)并迅速與AhR核轉(zhuǎn)位子(AhRnucleartranslocator，ARNT)結(jié)合到二噁英反應(yīng)元件上，進(jìn)而反式激活編碼異性生物質(zhì)代謝酶Ⅰ、Ⅱ的基因，比如細(xì)胞色素P450s。近幾十年來(lái)，大家已經(jīng)圍繞AhR介導(dǎo)的毒性效應(yīng)進(jìn)行了大量的研究。越來(lái)越多的證據(jù)表明，AhR可能在受體介導(dǎo)的信號(hào)通路中扮演著重要角色。比如，Lee等人曾經(jīng)在野生型和AhR基因敲除型（AR-/-）小鼠的RorγT+細(xì)胞中通過(guò)微

6、陣列芯片分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)Notch1是AhR的一個(gè)下游作用靶點(diǎn)。另外，Qiu等人研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)敲除AhR基因可以明顯降低白介素7受體α(Interleukin-7 receptorα，IL-7Rα)的表達(dá)，Kiss等人也曾經(jīng)報(bào)道稱在敲除AhR基因的固有淋巴細(xì)(innate lymphoid cells，ILCs)中，編碼具有酪氨酸蛋白激酶活性的生長(zhǎng)因子受體的原癌基因cKit的表達(dá)量顯著下降?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)內(nèi)源性的AhR可能是通過(guò)調(diào)節(jié)

7、KGFR的表達(dá)從而影響KGF介導(dǎo)的信號(hào)通路的。
　　方法:
　　一、成年(6-8周)C57BL/6J小鼠和C57BL/6J AhR-/-小鼠均被隨機(jī)分成四組:對(duì)照組、KGF干預(yù)組、AhR-/-+KGF組、AhR-/-組，每組包括6只小鼠。KGF藥物干預(yù)第五天處死小鼠并取小腸進(jìn)行分析。通過(guò)增殖細(xì)胞核抗原(Proliferati ng Cell Nuclear Antigen，PCNA)免疫組織化學(xué)來(lái)檢測(cè)上皮細(xì)胞(epithel

8、ial cell，EC)的增殖情況，通過(guò)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色來(lái)反映小腸的組織形態(tài)學(xué)變化，通過(guò)檢測(cè)絨毛高度、隱窩深度、小腸濕重、RNA及蛋白質(zhì)含量等指標(biāo)來(lái)反映不同組別小腸的變化。
　　二、通過(guò)免疫印跡(western blot，WB)技術(shù)檢測(cè)成年(6-8周)C57BL/6J小鼠和C57BL/6JAhR-/-小鼠的小腸上皮AhR蛋白表達(dá)水平，從而評(píng)估AhR基因敲除效果。通過(guò)WB和實(shí)時(shí)熒光定量聚合

9、酶鏈反應(yīng)(Real-time Polymerase Chain Reaction，Real-time PCR)技術(shù)來(lái)檢測(cè)對(duì)照組和AhRKO組小腸上皮中KGFR的表達(dá)水平。
　　三、使用針對(duì)AhR的小干擾RNA(siAhR)沉默LoVo細(xì)胞中的AhR基因，細(xì)胞分為對(duì)照組、轉(zhuǎn)染siNC組、siAhR組等三組。AhR的表達(dá)通過(guò)WB檢測(cè)，KGFR的表達(dá)水平通過(guò)WB和Real-timePCR檢測(cè)。分別提取核蛋白和總蛋白后，通過(guò)WB檢測(cè)E2F

10、1的表達(dá)水平。
　　四、使用針對(duì)E2F1的小干擾RNA(siAhR)沉默LoVo細(xì)胞中的E2F1基因，細(xì)胞分為三組，即對(duì)照組、轉(zhuǎn)染siNC組、siE2F1組，利用WB技術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞中E2F1和KGFR的表達(dá)水平。
　　五、對(duì)LoVo細(xì)胞進(jìn)行KGF和/或siAhR干預(yù)處理，分為四組，即DMSO組、KGF干預(yù)組、siAhR干預(yù)組、KGF+siAhR組。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞周期分析等實(shí)驗(yàn)手段對(duì)LoVo細(xì)胞進(jìn)行增殖方面的研究。<

11、br>　　結(jié)果:
　　1、與對(duì)照組相比，KGF干預(yù)組的小腸組織PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著升高，而AhR-/-組KGF誘導(dǎo)的腸上皮增殖細(xì)胞數(shù)量顯著降低。與KGF干預(yù)組相比，敲除AhR基因?qū)е驴漳c的絨毛高度顯著下降、隱窩深度顯著變淺，小腸濕重以及RNA、蛋白質(zhì)的含量也明顯降低（*P＜0.05）。
　　2、經(jīng)檢測(cè)AhR-/-組小鼠小腸上皮組織內(nèi)AhR含量可以發(fā)現(xiàn)AhR已成功敲除。生理狀態(tài)下，無(wú)論是蛋白水平還是mRNA水平，敲除AhR

12、基因都導(dǎo)致了腸上皮細(xì)胞內(nèi)KGFR的表達(dá)量顯著降低(*P＜0.05)。
　　3、通過(guò)WB檢測(cè)AhR的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，在使用siAhR的組中，AhR基因被成功沉默。WB及Real-timePCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AhR基因沉默的細(xì)胞KGFR在蛋白水平和mRNA水平均顯著降低。利用WB檢測(cè)E2F1蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，在核蛋白中，siAhR組E2F1與其他組相比，表達(dá)水平顯著降低，而在總蛋白中，三組表達(dá)水平并無(wú)顯著性差異(*P＜0.05

13、)。
　　4、利用WB檢測(cè)E2F1蛋白發(fā)現(xiàn)LoVo細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染siE2F1。WB及Real-timePCR結(jié)果顯示，E2F1基因沉默的細(xì)胞內(nèi)KGFR的表達(dá)水平與其他組相比顯著下降(*P＜0.05)。
　　5、通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，KGF組的細(xì)胞數(shù)量顯著高于其他組。流式細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示KGF組被阻滯在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量顯著低于其他組，而處于S期的細(xì)胞數(shù)量則顯著高于其他組(*P＜0.05)。
　　結(jié)論:
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