HRE啟動子調(diào)控分泌表達PR39重組AAV的構(gòu)建及在CHD基因治療中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的
　　為了探討HRE啟動子控制下分泌表達PR39重組AAV對缺血性心臟病基因治療，本實驗首先人工合成微小HRE，構(gòu)建T-HRE-CMV-PolyA載體，再將NT4-TAT-His-PR39裝入HRE調(diào)節(jié)的腺相關(guān)病毒載體，驗證其在人臍靜脈內(nèi)皮細胞（CRL-1730細胞株）表達、及其在豬AMI后對心肌細胞促血管生成作用。
　　方法
　　1﹑設(shè)計微小HRE/CMV，應(yīng)用PCR技術(shù)人工合成和T載體克隆法克隆，酶切鑒定后進行

2、DNA測序及分析。2﹑將編碼HRE/CMV、NT4-6His-PR39的基因片段用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建成質(zhì)粒pSS-HRE-CMV-NT4-6His-PR39-PolyA-AAV。3﹑采用磷酸鈣沉淀法三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，包裝成重組病毒，并應(yīng)用斑點雜交試驗測定其滴度。4﹑等體積pSS-HRE-CMV-NT4-6His-PR39-PolyA-AAV和空病毒（EV）分別感染人臍靜脈內(nèi)皮細胞（CRL-1730細胞株），免疫細胞

3、化學(xué)測定6×His在CRL-1730內(nèi)表達情況，驗證PR39的表達情況。5﹑18只小型豬建立AMI模型后隨機分為實驗組1（HRE-AAV-PR39組）、對照組1（生理鹽水組）、對照組2（空病毒組），應(yīng)用MR電影技術(shù)和心肌灌注MR成像，來評估缺血區(qū)的范圍。定期處死豬后，獲取缺血區(qū)心肌標(biāo)本，收集形態(tài)學(xué)、病理學(xué)數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果
　　1﹑根據(jù)文獻和數(shù)據(jù)庫資料，設(shè)計迄今最小HRE序列，經(jīng)PCR技術(shù)成功合成，并插入到pGEM-Teasy

4、質(zhì)粒中進行克隆，送DNA測序檢測，其結(jié)果與設(shè)計的序列一致。
　　2﹑單酶切法獲得大量的HRE，再連入改造后的pSSHGAAV（pSSV9int-/XbaI）載體，再經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后插入已合成的NT4-6His-PR39基因片段，兩次反應(yīng)均經(jīng)酶切鑒定正確，說明重組質(zhì)粒pSS-HRE-CMV-NT4-6His-PR39-PolyA-AAV構(gòu)建成功。
　　3﹑采用磷酸鈣沉淀法三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細胞，并應(yīng)用斑點雜交試驗

5、測定其滴度大小為3.4×109p.f.u。
　　4﹑免疫細胞化學(xué)測定CRL-1730中HRE調(diào)控下NT4-TAT-His-PR39中的6×His表達，實驗組陽性表達有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5﹑心肌MR灌注成像顯示梗死心肌面積在pSS-HRE-CMV-NT4-PR39-PolyA-AAV作用下明顯減小，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論
　　1﹑使用PCR方法可以將人工合成的HER插入缺乏內(nèi)切酶識別點的CMV啟動子上游，并制備低

6、氧調(diào)控的真核表達載體。
　　2﹑成功構(gòu)建pSS-HRE-CMV-NT4-TAT-6His-PR39-PolyA-AAV，并包裝成較高濃度的病毒。
　　3﹑免疫細胞化學(xué)測定CRL-1730中人工合成的微小HRE能夠有效的調(diào)控CMV啟動子控制的下游基因NT4-TAT-His-PR39表達。
　　4﹑MR電影技術(shù)和心肌灌注MR成像可有效定量評價AMI的范圍和心肌血流灌注。
　　5﹑重組pSS-HRE-CMV-NT4-P