膠質(zhì)瘤特異性4optHBS-Msi1-GFAP啟動子的構(gòu)建評價及其在基因治療中的初步應(yīng)用.pdf

1、腦膠質(zhì)細胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見惡性腫瘤，預(yù)后差，現(xiàn)有治療手段均不能顯著改善該類患者的預(yù)后。由于膠質(zhì)瘤具有原位復(fù)發(fā)的特性使之非常適合基因治療。實驗室前期的工作證實1型腺相關(guān)病毒(rAAV, recombined adeno-associatedvirus)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率最高，膠質(zhì)細胞親和性強，很適合用于膠質(zhì)瘤的基因治療。因此尋找并構(gòu)建膠質(zhì)瘤細胞特異性高效的表達元件，將為rAAVl用于膠質(zhì)瘤的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　 Mu

2、sashil蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP分別是CNS膠質(zhì)瘤細胞和膠質(zhì)細胞內(nèi)特異表達的蛋白，其各自特異啟動子均能啟動整合在其下游的外源基因表達。膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)部處于相對缺氧微環(huán)境，而優(yōu)化的HIF蛋白結(jié)合位點(optHBS，optimized HIF binding site)序列對低氧敏感。
　　 實驗中我們利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測出可能的P/Msil序列(M1/2/3/4)，通過基因克隆技術(shù)，構(gòu)建M1/2/3/4,GFAP及4op

3、tHBS-Msil/GFAP啟動子序列，連接到報告基因載體pGL3-Basic，然后在U251，BT325，HeLa，SH-SY5Y,PC12,293T細胞系中測定其相對熒光活性。
　　 結(jié)果：發(fā)現(xiàn)M1序列(chr12：119，291，292-119，292，123)為P/Msil活性序列所在。在U251，BT325中P/GFAP較P]Msil有更強的啟動子活性；在SH-SY5Y,HeLa中僅有P/Msil有較強啟動活性；而在P

4、C12（神經(jīng)元模型），293T中兩者均無啟動子活性，初步證實了兩啟動子的有效性和細胞特異性。4optHBS-Msil/GFAP啟動子功能在0.3％氧濃度下比在19.606下，于U251細胞內(nèi)增強約4.01倍和2.67倍，于bt325細胞內(nèi)增強約4.96倍和3.09倍。
　　 最后我們構(gòu)建了40ptHBS-Msil/GFAP-Baxα真核表達載體，體外轉(zhuǎn)染U251，BT325細胞，48小時WesternBlot檢測細胞中Bax表達