雙特異性啟動(dòng)子調(diào)控的溶瘤腺病毒攜帶P53基因?qū)δX膠質(zhì)瘤影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本研究通過構(gòu)建針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤 U251細(xì)胞的溶瘤腺病毒，通過病毒上的 hTERT啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒 E1A自我復(fù)制基因，利用 GFAP啟動(dòng)子調(diào)控 P53基因；在膠質(zhì)瘤存在的條件下，溶瘤病毒自我復(fù)制出 P53蛋白，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的目的，實(shí)現(xiàn)靶向性基因治療。
　　方法:由上海生物公司構(gòu)建hTERT啟動(dòng)子引導(dǎo)腺病毒早起蛋白（early region1A，E1A)基因同時(shí)GFAP啟動(dòng)子調(diào)控 P53基因的條件復(fù)制腺病毒。293T細(xì)胞被腺病毒

2、轉(zhuǎn)染后，利用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法（Tissue culture infective dose50，TCID50）檢測(cè)溶瘤腺病毒滴度，計(jì)算病毒感染293T細(xì)胞后的pfu值；用免疫蛋白印跡檢測(cè)P53蛋白的表達(dá)量；用 MTT法檢測(cè)重組腺病毒 Ad-Tp-E1A-Gp-P53對(duì)于人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U251生長(zhǎng)的抑制作用；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)用的重組腺病毒 Ad-Tp-E1A-Gp-P53的 TCID50測(cè)定結(jié)果為

3、：病毒活性 T(lU/ml):3.2×1011PFU/ml。Western印跡雜交證實(shí)了溶瘤腺病毒攜帶的人野生型 P53基因在 U251細(xì)胞中成功表達(dá)，隨著MOI增加，其蛋白相對(duì)表達(dá)量呈逐漸增加趨勢(shì)，兩兩之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MTT法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ad-Tp-E1A-Gp-P53對(duì)腫瘤細(xì)胞都具有明顯的抑制生長(zhǎng)的作用（P＜0.05）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果提示隨著 MOI的增加，凋亡率逐漸增加,提示重組腺病毒Ad-

4、Tp-E1A-Gp-P53作用于 U251細(xì)胞組后死亡率明顯高于對(duì)照組。
　　結(jié)論：hTERT及 GFAP啟動(dòng)子攜帶 P53的重組條件復(fù)制性腺病毒可大量表達(dá) P53蛋白，作用于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后具有比較好的生長(zhǎng)抑制的有效性，且對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞有一定的凋亡作用。它既保留了野生型腺病毒對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞高感染性的特點(diǎn)，又實(shí)現(xiàn)了在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的特異性復(fù)制，從而大大降低了其對(duì)于周圍正常細(xì)胞的副作用。且重組溶瘤腺病毒 Ad-Tp-E1A-Gp-P5