Ⅱ類啟動(dòng)子調(diào)控CRISPR系統(tǒng)中sgRNA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)特異性的基因突變.pdf

1、CRISPR/Cas9系統(tǒng)，作為新興的強(qiáng)有力的基因編輯以及遺傳篩選工具，通過體外基因編輯，在疾病模型的建立以及基因治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域方面具有廣泛的的應(yīng)用前景。然而，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在實(shí)際應(yīng)用過程中仍然面臨著一些技術(shù)難題，問題之一就在于很難進(jìn)行精準(zhǔn)可控的基因編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在行使基因編輯功能的過程中主要包括兩個(gè)成員，Cas9蛋白和單鏈的引導(dǎo)RNA（sgRNA）。其中Cas9蛋白是由RNA聚合酶Ⅱ(polⅡ)類啟動(dòng)

2、子調(diào)控表達(dá)的一種核酸酶，可以進(jìn)行組織細(xì)胞的特異性表達(dá)調(diào)控。sgRNA用于識別靶位點(diǎn)，其轉(zhuǎn)錄是受到RNA聚合酶Ⅲ(polⅢ)類啟動(dòng)子調(diào)控的。而Ⅲ類啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的一大缺陷就在于難以控制，受其調(diào)控的基因一般會(huì)呈現(xiàn)出類似于看家基因的“無處不在”表達(dá)的特點(diǎn)，因此使sgRNA也能以一種組織特異性表達(dá)調(diào)控的方式進(jìn)行表達(dá)更有利于組織特異性基因突變的產(chǎn)生。本文中對經(jīng)典的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行巧妙的修改，使sgRNA也能在RNA聚合酶Ⅱ類啟動(dòng)子的

3、調(diào)控下進(jìn)行表達(dá)，并進(jìn)一步通過使用細(xì)胞特異性啟動(dòng)子來調(diào)控sgRNA的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞特異性的基因突變。
　　為了能獲得RNA聚合酶Ⅱ類啟動(dòng)子調(diào)控的sgRNA，構(gòu)建獲得microRNA-shRNA與sgRNA鑲嵌（miRsh-sgRNA）盒。該結(jié)構(gòu)中的sgRNA是受RNA聚合酶Ⅱ類啟動(dòng)子調(diào)控的，并能夠從紅色熒光蛋白的3'非翻譯區(qū)(UTR)轉(zhuǎn)錄出來，為了檢測功能性的sgRNA能否在此結(jié)構(gòu)中順利產(chǎn)生，將廣譜性啟動(dòng)子EF1a調(diào)控的miRs

4、h-sgp53表達(dá)載體以及Cas9-P2A-EGFP表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞（MEFs）和小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)。轉(zhuǎn)然后兩基因一般會(huì)呈現(xiàn)出類似于看家基因的“無處不在”表達(dá)的特點(diǎn)，因此使sgRNA也能以一種組織天采用流式細(xì)胞分選(FACS)的方式分選出雙熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞，并對分選出的細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行T7EN1酶切及sanger測序，結(jié)果表明無論是MEFs還是mESCs，EF1a啟動(dòng)子調(diào)控miRsh-sgp53產(chǎn)生的sgRNA都

5、能夠引導(dǎo)Cas9蛋白對p53基因進(jìn)行雙鏈切割(DSB)。為了進(jìn)一步證實(shí)是否miRsh-sgRNA盒能夠以細(xì)胞類型特異性的方式產(chǎn)生基因突變，構(gòu)建獲得小鼠胚胎類啟動(dòng)子調(diào)控的。而Ⅲ類啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的一大缺陷就在于難以控制，受其調(diào)控的基因一般會(huì)呈現(xiàn)出類干細(xì)胞特異性的Oct4啟動(dòng)子（mOct4P）來調(diào)控sgRNA表達(dá)的miRsh-sgp53盒，將該載體以及EF1a啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的Cas9-P2A-EGFP表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染MEFs和mESCs兩天后

6、，在mESCs中，能夠觀察到紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白共同表達(dá)的細(xì)胞，但在MEFs中，僅有綠色熒光蛋白的表達(dá)，這一現(xiàn)象表明sgRNA以細(xì)胞類型特異性的方式產(chǎn)生。通過流式細(xì)胞分選的方式分選出這兩類細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行T7EN1酶切及sanger測序分析。發(fā)現(xiàn)p53基因的突變僅發(fā)生在小鼠胚胎干細(xì)胞中，而沒有發(fā)生在小鼠成纖維細(xì)胞中。此外，T7EN1酶切及sanger測序表明構(gòu)建的這種由RNA聚合酶Ⅱ類啟動(dòng)子調(diào)控CRISPR/Cas9系統(tǒng)較經(jīng)典的CR