吡唑并嘧啶銅類化合物對KCNQ2-3通道作用的構(gòu)效關(guān)系與機(jī)制研究.pdf

1、M電流是由Brown及Adams于1980年首次在牛蛙頸上交感神經(jīng)節(jié)中發(fā)現(xiàn)的一種具有電壓依賴性、慢激活、非失活、慢去活等特征的外向鉀電流。由于這種外向鉀電流可被M型受體激動劑毒蕈堿(Muscarine)強(qiáng)烈抑制，因而得名為M電流，其離子通道稱為M通道。目前人們認(rèn)為KCNQ家族成員(KCNQ2-5)構(gòu)成的同源四聚體或異四聚體是構(gòu)成M通道的分子基礎(chǔ)。以KCNQ為分子基礎(chǔ)的M電流對于維持和穩(wěn)定神經(jīng)元的興奮性發(fā)揮著重要作用。M電流被抑制后，細(xì)胞

2、膜發(fā)生去極化，使膜電位更接近閾電位，細(xì)胞更易爆發(fā)動作電位，神經(jīng)元的興奮性增加。研究發(fā)現(xiàn)，KCNQ2和KCNQ3基因突變可誘發(fā)由于神經(jīng)元過度興奮所致的家族遺傳性新生兒驚厥癥(benign familial neonatal convulsions，BFNC)和癲癇等疾病。最近研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元M電流還參與外周疼痛感覺的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)性疼痛。因而，研究和開發(fā)KCNQ鉀通道的開放劑對于治療這些中樞興奮性疾病和疼痛具有重要意義。
　　 以

3、KCNQ通道為分子作用靶點(diǎn)的新型抗癲癇化合物的研究已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，并取得重要進(jìn)展。瑞替加濱(retigabine)就是在該背景下所研制出的代表性的一類新型抗癲癇藥。最近研究發(fā)現(xiàn)其他化學(xué)結(jié)構(gòu)化合物，如羥基吲哚類似物BMS-204352，滅酸類化合物如甲氯芬那酸、雙氯芬酸和NH6，吡硫鋅，ICA-27243以及ICA-105665等也是KCNQ通道的強(qiáng)激活劑。以KCNQ通道為分子作用靶點(diǎn)為研發(fā)治療癲癇和驚厥等中樞興奮性疾病藥

4、物開辟了新的方向。
　　 我室聯(lián)合本校新藥研發(fā)中心合成了一系列針對KCNQ通道為分子作用靶點(diǎn)的全新結(jié)構(gòu)化合物，通過原子吸收Rb+流出測定的高通量篩選技術(shù)初步尋找到若干對KCNQ通道具有激活作用的化合物。本論文主要利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)詳細(xì)系統(tǒng)地研究這些激活劑（主要是QO-26、QO-28、QO-40和QO-41四種化合物）對KCNQ2/3通道的作用，探討不同結(jié)構(gòu)化合物對KCNQ2/3通道作用的構(gòu)效關(guān)系與作用機(jī)制，從而為進(jìn)一步研究和

5、開發(fā)高效、安全的KCNQ通道激活劑奠定基礎(chǔ)。論文具體內(nèi)容如下：
　　 第一部分、CHO細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的KCNQ2/3鉀離子通道電流的鑒定
　　 目的：對轉(zhuǎn)染KCNQ2/3通道蛋白的CHO細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證，建立研究KCNQ2/3通道電流的方法，為下一步研究藥物對通道的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：采用分子生物學(xué)western blot方法對CHO細(xì)胞中KCNQ2和KCNQ3蛋白的表達(dá)進(jìn)行測定，以兩性霉素B為打孔劑

6、采用穿孔全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察通道電流特征和藥理學(xué)特性。
　　 結(jié)果：(1)應(yīng)用westem blot方法，在蛋白水平同時(shí)檢測到KCNQ2和KCNQ3的表達(dá)，分子量約97kDa。此外，以空白CHO細(xì)胞為陰性對照，未檢測到兩種通道蛋白的表達(dá)。電生理學(xué)結(jié)果表明，在未轉(zhuǎn)染通道的CHO細(xì)胞上，未記錄到KCNQ2/3電流，而在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞上記錄到特征明顯的KCNQ2/3電流。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KCNQ2和KCNQ3共表達(dá)于CHO細(xì)胞中，且功能正常。

7、(2)以如下程序記錄KCNQ2/3電流。將膜電位鉗制于-80mV，然后以10mV的階躍電壓將去極化電位由-130mV逐步增加至+60mV，然后將電壓復(fù)極化至-120mV。在此電壓鉗制程序之下，在去極化激活通道的過程中，隨著去極化電壓的增大，穩(wěn)態(tài)激活電流也隨之增大，且無明顯失活，即電流呈現(xiàn)慢激活、非失活、電壓依賴性特征，初步證明KCNQ2/3通道穩(wěn)定表達(dá)于CHO細(xì)胞中。記錄一系列從不同去極化電壓(-130mV～+60mV)復(fù)極化至-120

8、mV所產(chǎn)生的內(nèi)向尾電流，即可測得不同去極化電壓激活通道的程度。用Boltzmann方程擬合尾電流-電壓關(guān)系曲線，求得通道的半數(shù)激活電壓V1/2為-2.2±1.5mV，曲線斜率因子k為21.7±1.2。對激活電流曲線用單指數(shù)方程進(jìn)行擬合，即可得到不同激活電壓下通道的激活時(shí)間常數(shù)(Tauact)。KCNQ2/3通道的激活時(shí)間常數(shù)具有電壓依賴性，隨著激活電壓的增大，激活時(shí)間常數(shù)縮短，通道開放速率加快。將膜電位鉗制于-80mV，然后給予一段前置

9、去極化電壓(+40mV)使通道以最大程度充分激活，然后以10mV的階躍電壓將鉗制電位由0mV逐步降低至-140mV，可見通道逐漸去活的變化，去活曲線用單指數(shù)方程進(jìn)行擬合，即可得到不同激活電壓下通道的去活時(shí)間常數(shù)(Taude。通道在較負(fù)電壓下(-140mV～-100mV)去活時(shí)程較快，而在較正電壓下(-90mV～-20mV)去活時(shí)程較慢，提示隨著去活電壓的增大，通道去活速率減慢。(3)鉀通道阻斷劑對KCNQ2/3電流的影響：M通道的特異性

10、阻斷劑linopirdine可濃度依賴性地抑制KCNQ2/3電流，最大抑制率為95.5±1.1％，半數(shù)抑制濃度IC50為0.8±0.08μM，Hill系數(shù)為0.91±0.06。TEA可濃度依賴性地抑制KCNQ2/3電流，最大抑制率為92.92±1.6％，半數(shù)抑制濃度IC50為1.76±0.08mM，Hill系數(shù)為1.01±0.05。
　　 結(jié)論：Western blot和電生理實(shí)驗(yàn)表明KCNQ2和KCNQ3共表達(dá)于CHO細(xì)胞中，

11、通道電流的電生理學(xué)特征及藥理學(xué)特性均符合KCNQ2/3電流特征，說明KCNQ2/3穩(wěn)定表達(dá)于CHO細(xì)胞中，該細(xì)胞系可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　 第二部分、吡唑并嘧啶酮類化合物對KCNQ2/3通道作用的構(gòu)效關(guān)系研究
　　 目的：測定四種不同結(jié)構(gòu)的吡唑并嘧啶酮類化合物(QO-26、QO-28、QO-40和QO-41)對穩(wěn)轉(zhuǎn)的KCNQ2/3通道電流作用的效能和效價(jià)，并與陽性對照藥retigabine(RTG)的作用進(jìn)行比較，從而

12、分析該系列化合物作用于KCNQ2/3通道的構(gòu)效關(guān)系。觀察吡唑并嘧啶酮類化合物對大鼠背根神經(jīng)元的M通道電流的影響。
　　 方法：主要以兩性霉素B為打孔劑采用穿孔全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察化合物對KCNQ2/3電流或M電流的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)果：(1)QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均能濃度依賴性地增大KCNQ2/3電流，具有通道開放劑特征。四種化合物對KCNQ2/3電流的作用表現(xiàn)出不同的效能和效價(jià)特征。分別觀察了

13、四種化合物對在-40mV和-20mV下記錄的KCNQ2/Q3電流激活作用的的半數(shù)有效濃度(EC50)及最大作用。QO-26的EC50分別為47.93±5.04μM和21.35±2.24μM；增大電流的最大倍數(shù)分別為4.76±0.67和1.04±0.16。QO-28的EC50分別為31.51±6.66μM和12.57±4.21μM；增大電流的最大倍數(shù)分別為13.36±2.07和2.68±0.4。QO-40的EC50分別為15.4±0.56

14、μM和6.10±1.83μM；增大電流的最大倍數(shù)分別為6.60±1.73和0.78±0.07。QO-41的EC50分別為9.04±1.53μ,M和3.27±0.47μM;增大電流的最大倍數(shù)分別為8.44±1.55和1.50±0.12。陽性對照藥retigabine的EC50分別為2.93±0.25μM和1.90±0.06μM;增大電流的最大倍數(shù)分別為11.86±0.95和2.95±0.32。(2)QO-41能增大大鼠小直徑背根神經(jīng)元上的

15、M電流，其在-60mV作用下的半數(shù)有效濃度EC50為7.09±1.8μM。
　　 結(jié)論：(1)吡唑并嘧啶酮類化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均能增大表達(dá)于CHO細(xì)胞中的KCNQ2/3電流，且具有濃度依賴性。其中QO-28的效能最強(qiáng)，其對KCNQ2/3通道的作用程度與陽性對照藥retigabine相當(dāng)；QO-41的效價(jià)最高，但弱于陽性對照藥retigabine。以QO-41為代表的吡唑并嘧啶酮類化合物也能濃度依

16、賴性地增大大鼠小直徑背根神經(jīng)元上的M電流。(2)通過對一系列吡唑并嘧啶酮類化合物的構(gòu)效關(guān)系研究表明，以吡唑并嘧啶酮為母核的化合物，其2位上的吸電子基團(tuán)三氟甲基(CF3)，3位上的芳香基團(tuán)苯環(huán)或萘環(huán)以及5位上的吸電子基團(tuán)一氯甲基(CH2C1)或三氟甲基(CF3)是維持化合物活性所必須的基團(tuán)，且三氟甲基的活性強(qiáng)于一氯甲基，說明5位取代基團(tuán)吸電子能力越強(qiáng)，其化合物活性也越好。
　　 第三部分、吡唑并嘧啶酮類化合物對KCNQ2/3通道作

17、用的機(jī)制研究
　　 目的：測定四種不同結(jié)構(gòu)的吡唑并嘧啶酮類化合物(QO-26、QO-28、QO-40和QO-41)對KCNQ2/3通道激活和去活過程的影響，并采用聯(lián)合給藥和測定突變體KCNQ2(W236L)電流的方法初步研究化合物作用于KCNQ2/3通道的分子機(jī)制。
　　 方法：主要以兩性霉素B為打孔劑采用穿孔全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察化合物對KCNQ2/3電流或KCNQ2(W236L)電流的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)果：(

18、1)給予最大濃度的四種化合物和retigabine，分析其對KCNQ2/3電流-電壓關(guān)系曲線的影響，發(fā)現(xiàn)上述藥物在KCNQ2/3電流激活閾電位至+60mV電壓范圍內(nèi)，均能使KCNQ2/3穩(wěn)態(tài)激活電流幅度增大，并使閾電位水平向超極化方向移動，即在化合物的作用下，KCNQ2/3通道在更負(fù)的電壓下即可開放。(2)給予最大濃度的四種化合物，均能明顯使KCNQ2/3的激活曲線向超極化方向移動，半數(shù)激活電壓V1/2的變化值依次為200μMQO-28

19、(-34.2mV)＞100μMQO-40(-21.11mV)＞300μMQO-26(-18.14mV)＞100μMQO-41(-16.92mV)。陽性對照藥30μMRTG的半數(shù)激活電壓V1/2的左移程度最大，其變化程度為-40.06mV?；衔镆鸬耐ǖ腊霐?shù)激活電壓V1/2的變化值具有濃度依賴性，隨著濃度的增加，左移程度也增大。(3)不同激活電壓下(-40mV～+30mV)KCNQ2/3電流的激活時(shí)間常數(shù)(Tauact)在給藥前后均表現(xiàn)

20、出電壓依賴性，隨著激活電壓的增大，激活時(shí)間常數(shù)縮短，通道開放速率加快。在-40mV～+30mV范圍內(nèi)，QO-26、QO-28和QO-41與對照（不給藥）相比能明顯增大通道的激活時(shí)間常數(shù)，使通道激活速率減慢，且激活時(shí)間常數(shù)隨化合物濃度的增加而增大(-30mV激活)。QO-40對通道的激活動力學(xué)無明顯影響。在-30mV及更負(fù)電壓下陽性對照藥retigabine使通道的激活速率加快，且激活時(shí)間常數(shù)隨化合物濃度的增加而減小。(4)不同電壓水平下

21、(-140mV～-20mV)KCNQ2/3通道的去活時(shí)間常數(shù)(Taudeact)在對照情況下（不給藥）表現(xiàn)出電壓依賴性，隨著去活電壓向超極化方向變化，去活時(shí)間常數(shù)減小，通道去活速率加快。與對照相比，四種化合物及retigabine均使KCNQ2/3通道的去活動力學(xué)過程減慢。(5)與單獨(dú)給藥相比，同時(shí)給予最大濃度的吡唑并嘧啶酮類化合物與retigabine的混合物，可產(chǎn)生復(fù)合效應(yīng)，即在閾電位水平至+60mV電壓范圍內(nèi)，相對于單獨(dú)給藥，穩(wěn)態(tài)

22、激活電流均明顯增大，閾電位水平向超極化方向移動。(6)分析通道在+60mV下的激活動力學(xué)時(shí)程和-120mV下的去活動力學(xué)時(shí)程，結(jié)果提示，與單獨(dú)給藥相比，給予吡唑并嘧啶酮類化合物與retigabine的混合物能明顯延長通道的去活時(shí)程，使通道去活減慢。此外，QO-28與retigabine的混合物比單獨(dú)作用時(shí)，明顯延長通道的激活時(shí)程，使通道激活減慢。(7)在閾電位至+20mV范圍內(nèi)，給予200μMQO-28，使突變體通道KCNQ2(W236

23、L)的穩(wěn)態(tài)激活電流幅度增大，而retigabine無明顯影響。200μMQO-28仍然能夠使KCNQ2(W236L)通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線向超極化方向移動，而retigabine無明顯影響；KCNQ2(W236L)通道在對照、給予200μMQO-28和30μMretigabine三種情況下的半數(shù)激活電壓(V1/2)分別為-9.0±1.7mV,-38.5±1.0mV和-3.2±2.2mV。
　　 結(jié)論：(1)在KCNQ2/3激活的閾電

24、位至+60mV電壓范圍內(nèi)，吡唑并嘧啶酮類化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均能使KCNQ2/3穩(wěn)態(tài)激活電流幅度增大，并使閾電位水平向超極化方向移動。(2)吡唑并嘧啶酮類化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均能明顯使KCNQ2/3通道的激活曲線向超極化方向移動（左移），且具有濃度依賴性。與陽性對照藥retigabine加速KCNQ2/3通道的激活過程不同，QO-26、QO-28和QO-41明顯減慢通道的激

25、活過程，而QO-40對通道激活動力學(xué)無影響。QO-26、QO-28、QO-40、QO-41和RTG均能明顯減慢通道的去活動力學(xué)過程。激活時(shí)間常數(shù)和去活時(shí)間常數(shù)均具有電壓依賴性和濃度依賴性。吡唑并嘧啶酮類化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41可能主要通過使穩(wěn)態(tài)激活電流幅度增大、激活曲線左移和減慢去活時(shí)程等方面而增強(qiáng)KCNQ2/3通道功能。(3)應(yīng)用聯(lián)合給藥方法產(chǎn)生的復(fù)合效應(yīng)和測定化合物對突變體KCNQ2(W236L)通道的作

26、用結(jié)果提示，吡唑并嘧啶酮類化合物調(diào)節(jié)KCNQ2/3通道的機(jī)制可能不同于retigabine。
　　 結(jié)論：
　　 1.Western blot和電生理實(shí)驗(yàn)表明KCNQ2和KCNQ3共表達(dá)于CHO細(xì)胞中，通道電流的電生理學(xué)特征及藥理學(xué)特性均符合KCNQ2/3電流特征，說明KCNQ2/3穩(wěn)定表達(dá)于CHO細(xì)胞中，該細(xì)胞系可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　 2.吡唑并嘧啶酮類化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均

27、能增大表達(dá)于CHO細(xì)胞中的KCNQ2/3電流。其中QO-28的效能最強(qiáng)，其對KCNQ2/3通道的作用程度與陽性對照藥retigabine相當(dāng)；QO-41的效價(jià)最高，但弱于陽性對照藥retigabine。以QO-41為代表的吡唑并嘧啶酮類化合物也能濃度依賴性地增大大鼠小直徑背根神經(jīng)元上的M電流。通過對一系列吡唑并嘧啶酮類化合物的構(gòu)效關(guān)系研究表明，以吡唑并嘧啶酮為母核的化合物，其2位上的吸電子基團(tuán)三氟甲基(CF3)，3位上的芳香基團(tuán)苯環(huán)或萘

28、環(huán)以及5位上的吸電子基團(tuán)一氯甲基(CH2C1)或三氟甲基(CF3)是維持化合物活性所必須的基團(tuán)，且三氟甲基的活性強(qiáng)于一氯甲基，說明5位取代基團(tuán)吸電子能力越強(qiáng)，其化合物活性也越好。
　　 3.對KCNQ2/3通道的激活和去活動力學(xué)的進(jìn)一步分析研究表明，在KCNQ2/3激活的閾電位至+60mV電壓范圍內(nèi)，吡唑并嘧啶酮類化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均能使穩(wěn)態(tài)激活電流幅度增大，并使閾電位水平向超極化方向移動。吡唑

29、并嘧啶酮類化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均能明顯使通道的激活曲線向超極化方向移動（左移）。與陽性對照藥retigabine加速通道的激活過程不同，QO-26、QO-28和QO-41明顯減慢通道的激活過程，而QO-40對通道激活動力學(xué)無影響。QO-26、QO-28、QO-40、QO-41和retigabine均能明顯減慢通道的去活動力學(xué)過程。吡唑并嘧啶酮類化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41可能主要通