NLGN3和NLGN4X與中國(guó)人群兒童孤獨(dú)癥的相關(guān)性研究.pdf

1、背景:孤獨(dú)癥是一種嚴(yán)重影響兒童健康的神經(jīng)發(fā)育性疾病，其主要的臨床特征包括社會(huì)交往障礙、言語(yǔ)交流障礙、狹隘興趣和重復(fù)刻板行為等，通常3歲以?xún)?nèi)發(fā)病，男女比例約為4∶1-10∶1。孤獨(dú)癥患病率近年急劇上升，最新流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)孤獨(dú)癥的發(fā)病率已高達(dá)1.14-2.6％。孤獨(dú)癥的病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)一些比較確定的孤獨(dú)癥易感基因，這些基因主要參與神經(jīng)發(fā)育過(guò)程，如突觸發(fā)生和突觸可塑性等。
　　對(duì)孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)制的研究中最為廣泛的

2、是neurexin家族蛋白和neuroligin家族蛋白。而孤獨(dú)癥患者的男女差異性使得位于X染色體上的NLGN3和NLGN4X的研究尤為引人注目。NLGN3和NLGN4X編碼的蛋白屬哺乳動(dòng)物大腦突觸后細(xì)胞粘附因子，通過(guò)和neurexin相互作用在突觸結(jié)構(gòu)形成、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸的識(shí)別、突觸成熟及信息傳遞等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　方法:本研究前期工作中，通過(guò)直接測(cè)序?qū)?18名孤獨(dú)癥患者和453名正常對(duì)照的NLGN3和NLGN4X外

3、顯子序列及外顯子側(cè)翼序列進(jìn)行分析，我們?cè)诨颊呓M中發(fā)現(xiàn)了NLGN3和NLGN4X的10個(gè)已知SNPs和4個(gè)未報(bào)道的錯(cuò)義變異(p.G426S-NLGN3、p.G84R-NLGN4X、p.Q162K-NLGN4X和p.A283T-NLGN4X)，在正常對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)了13個(gè)SNPs(包括患者中發(fā)現(xiàn)的10個(gè)SNPs)。
　　本研究中針對(duì)這些變異，我們做了進(jìn)一步的研究與分析，希望能夠闡明他們?cè)诠陋?dú)癥發(fā)病中的作用和機(jī)制。我們主要從兩個(gè)方面進(jìn)行研

4、究。1.針對(duì)患者組和對(duì)照組共有的已知SNPs，通過(guò)基于病例-對(duì)照(Case-Control)的關(guān)聯(lián)研究闡明NLGN3和NLGN4X與中國(guó)人群中孤獨(dú)癥的相關(guān)性。2.我們所發(fā)現(xiàn)的4個(gè)錯(cuò)義突變，建立穩(wěn)定表達(dá)的HEK293細(xì)胞模型，通過(guò)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白免疫熒光染色，對(duì)NLGN3/4X野生型和相關(guān)突變體進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究;通過(guò)蛋白酶體抑制劑(MG132)和溶酶體抑制劑(CQ)來(lái)阻斷neuroligin3和neuroligin4X可能的降解途徑確定

5、相關(guān)突變體在細(xì)胞內(nèi)的降解途徑;通過(guò)CHX抑制蛋白合成，確定相關(guān)突變體的降解速率;通過(guò)neuroligin和IgG-△neurexin(-SS4)免疫共沉淀分析突變體是否影響neuroligin-neurexin復(fù)合體的形成。從而初步闡明NLGN突變蛋白能否正常行使其生理功能以及對(duì)突觸的影響。
　　結(jié)果:通過(guò)基于病例-對(duì)照(Case-Control)的關(guān)聯(lián)研究，我們發(fā)現(xiàn)NLGN4X的2個(gè)連鎖的常見(jiàn)SNP位點(diǎn)rs3747333和rs3

6、747334等位基因頻率和基因型頻率在患者組和對(duì)照組之間的有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(OR=4.685,95％CI=2.073-10.592, p=5.09E-05)。
　　對(duì)所發(fā)現(xiàn)的4個(gè)錯(cuò)義突變進(jìn)行生物學(xué)功能分析，通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)4個(gè)錯(cuò)義突變的相應(yīng)突變蛋白在非神經(jīng)元性的細(xì)胞HEK293細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞膜分布，和neuroligin3或neuroligin4X野生型蛋白沒(méi)有差異性;通過(guò)MG132和CQ藥物作用于相應(yīng)的細(xì)胞系，4個(gè)被檢突變蛋

7、白和野生型蛋白降解途徑主要通過(guò)泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑進(jìn)行降解;通過(guò)CHX藥物作用于相應(yīng)的細(xì)胞系，4個(gè)被檢突變蛋白的降解速率和野生型蛋白沒(méi)有明顯差異;通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4個(gè)被檢突變蛋白及野生型蛋白都能夠與IgG-△neurexin1β融合蛋白相結(jié)合而被沉淀，沒(méi)有明顯的差異。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果表明NLGN4X的2個(gè)連鎖的常見(jiàn)NP位點(diǎn)rs3747333和rs3747334與中國(guó)漢族人群孤獨(dú)癥顯著相關(guān)，NLGN4X是中國(guó)人群孤