RbAp48在HPV致宮頸癌中的功能研究.pdf

1、宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在世界范圍內發(fā)病率僅次于乳腺癌居第二位，大量的研究資料表明人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染是誘發(fā)宮頸癌的首要啟動因素，因此，加強HPV致宮頸癌機制的研究是有效防治宮頸癌的前提。 人乳頭瘤病毒是雙鏈DNA病毒，具有嗜上皮特性，能夠感染皮膚與粘膜的上皮組織并形成增生性疾病。高危型HPV(HPV16、18、33型等)與宮頸癌等惡性腫瘤的發(fā)生密切相關，低危型HPV

2、(HPV 6、11型)可導致尖銳濕疣等良性病變。本研究運用基于固體pH梯度等電聚焦雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis；2-DE)、肽質量指紋圖譜鑒定技術(Peptide Mass spectrometry analysis)和生物信息學(Bioinformatics)等蛋白質組學技術體系，鑒定了HPV16轉化的人宮頸上皮永生化細胞系H8和人宮頸癌細胞系Caski的差異蛋白，RbAp48作為其

3、中與腫瘤發(fā)生密切相關的差異表達蛋白質，引起了作者極大的興趣并以此為研究目標展開了深入的功能研究。RbAP48，作為一種Rb (retinoblastoma-binding protein)結合蛋白，是從涉及不同染色質集合、裝配以及核小體修飾復合物，包括組蛋白乙酰轉移酶(histonedeacetylase；HDAC)分離出的復合物中第一個被鑒定的高豐度蛋白。 本研究在國內外第一次系統(tǒng)全面的揭示了RbAP48與宮頸癌發(fā)生的密切關系

4、，體內細胞水平和體外動物實驗研究表明RbAP48是調控宮頸癌發(fā)病過程HPV轉化活性的至關重要的分子，為全面深刻的認識HPV致癌機理從而更好的預防防治奠定基礎。 一、RbAp48在宮頸癌中的低表達 利用雙向電泳技術對正常永生化細胞H8及宮頸癌細胞Caski總蛋白的分離，并通過蛋白質組學技術分析，成功鑒定出20個表達有差異的蛋白質。其中RbAp48作為一個在腫瘤細胞中低表達的蛋白引起作者極大的興趣。首先運用real-time

5、 PCR及western blot技術分別從RNA和蛋白水平上驗證了其表達在H8中明顯高于在Caski中的表達，然后又利用其他宮頸癌細胞系如SiHa、HeLa以及宮頸角質細胞HCK上也證實了RbAp48的表達在宮頸癌細胞中的普遍性。同時搜集臨床上其他腫瘤組織如乳腺癌、卵巢癌、胃癌等相關的腫瘤及正常組織，試圖發(fā)現(xiàn)RbAp48的表達在這些腫瘤中是否也有差異。Western blot分析顯示在這些腫瘤組織中，RbAp48的表達沒有明顯差別，這

6、證實了RbAp48的低表達在宮頸癌中的特異性。 二、RbAp48的表達變化可以影響細胞的增殖分化及體外腫瘤形成 利用RNAi(RNA干擾技術)構建能有效降低細胞內源性RbAp48表達的質粒pSUPER-RbAp48，將其轉入H8建立穩(wěn)定轉染的細胞系H8+siRbAp48，同時將pSUPER空載體轉染H8細胞作為對照組建立穩(wěn)定細胞系。通過比較分析兩種穩(wěn)定細胞系的增殖分化等的差異，可以明顯觀察到轉染pSUPER-RbAp48

7、的H8細胞能夠增加增殖細胞線粒體能量代謝過程中乳酸脫氫酶的釋放，從而促進細胞能量代謝：能夠促進細胞分裂增殖，細胞數(shù)目增加；增加細胞軟瓊脂克隆生長的數(shù)量；同時明顯降低反映細胞衰老死亡指標的β-細胞半乳糖苷酶的活性。這些實驗都表明降低細胞內源性的RbAp48的表達可以明顯促進體外細胞水平的增殖分化并抑制細胞的死亡衰老。 將穩(wěn)定轉染pSUPER-RbAp48和pSUPER空載體的細胞分別皮下注射裸鼠，四周后裸鼠體內腫瘤形成的情況表明，

8、由于RbAp48本身并不具備致瘤性，因此轉染pSUPER空載體的細胞注射的裸鼠體內沒有腫瘤形成；而穩(wěn)定轉染pSUPER-RbAp48細胞注射的6只裸鼠中有5只體內均長出腫瘤。 為了進一步研究RbAp48在腫瘤形成過程中的功能，從另一方面增加RbAp48的表達，觀察RbAp48的過表達對體內體外腫瘤發(fā)生的影響。分別轉染了RbAp48的表達質粒及pcDNA 3.1到Caski細胞中建立穩(wěn)定細胞系，進行細胞增殖實驗分析。MTT分析、細

9、胞生長曲線、以及軟瓊脂克隆形成試驗均表明過表達RbAp48明顯降低細胞的生長率，β-細胞半乳糖苷酶分析顯示細胞衰老率增加。體外裸鼠腫瘤形成試驗表明在宮頸癌細胞Caski中增加RbAp48的表達后，細胞的致瘤性明顯降低，裸鼠體內形成的腫瘤明顯縮小。 這些都表明RbAp48作為一種新發(fā)現(xiàn)的調控人乳頭瘤病毒HPVl6陽性的宮頸癌轉化活性的重要蛋白，能夠抑制腫瘤細胞的生長，降低其致瘤性，結合最近研究報道RbAp48作為一種腫瘤放射敏感性

10、蛋白，提示RbAp48可以作為一種HPV相關疾病的治療靶位用于臨床應用，為宮頸癌的預防和治療提供一種新的方向和理論依據(jù)。 三、RbAp48通過調節(jié)其他癌基因和抑癌基因的表達來影響腫瘤的發(fā)生 為了進一步探討RbAp48影響宮頸癌的機制，分別研究了其對腫瘤癌基因HPVE6、E7，c-myc，抑癌基因Rb，P53，以及Rb/E2F靶位基因的表達影響。 通過將RbAp48利用siRNA干擾之后，發(fā)現(xiàn)HPVE6、E7以及c

11、-myc基因的表達均上升，而抑癌基因Rb和p53的表達則明顯下降。另外本文還檢查了Rb/E2F 靶位基因的表達情況包括Cyclin A，Cyclin E，Cyclin D1，proliferating cell nuclear antigen(f)CNA)和p16INK4a，結果發(fā)現(xiàn)只有Cyclin D1的表達有所升高，也許是因為RbAp48通過影響Cyclin D1的表達來影響宮頸癌的分化。 四、ECM1在軟骨發(fā)育中抑制軟骨發(fā)

12、育的作用 本文通過酵母雙雜交試驗在研究COMP(Cartilage oligomericmatrix protein，軟骨寡聚基質蛋白)蛋白這一基質蛋白在軟骨發(fā)育中的作用時，用COMP蛋白的EGF片段做誘餌，篩選出來了ECM1(extracellular matrixprotein 1，細胞外基質蛋白1)這一細胞外基質蛋白。通過研究其與COMP的相互作用，明確了二者在體內外相互結合作用的模式，并發(fā)現(xiàn)ECM1具有抑制軟骨發(fā)育的作用