JunD在宮頸癌進展中的功能及其分子機制研究.pdf

1、宮頸癌是全球女性第四大常見惡性腫瘤，也是全球女性排名第四的死亡原因。雖然隨著篩查的大規(guī)模開展，手術及放化療的長足進展，宮頸癌的發(fā)生率和死亡率有一定下降，但中晚期宮頸癌患者的預后仍然不盡如人意，尋找中晚期宮頸癌有效的治療方法對改善該類患者的預后意義重大。高危人乳頭瘤病毒(High RiskHuman papillomavirus，HR-HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生與進展的必要因素。病毒癌基因通過影響宿主細胞的相關分子來擴大自身癌基因的惡性

2、效應，探索宿主細胞中受病毒影響的相關分子，是臨床研究中尋找潛在治療靶標的重點。
　　JunD蛋白是由JUND基因編碼，最晚加入Jun家族的成員，其表達方式及生物學功能與家族其它成員并不相同。JunD激活或抑制各種不同的靶基因介導細胞增殖、凋亡和分化等功能。在腫瘤細胞中，JunD蛋白的表達紊亂、對JunD的調(diào)控異常及與其它因子如MEN1、cyclinD1、p21、MMP-7等的相互作用，參與腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移、血管生成等過程。

3、　　為了明確JunD在宮頸癌進展中的功能及分子機制，本研究首先利用細胞功能實驗探索JunD在宮頸癌中對細胞生物學行為的影響，再通過生物信息學方法尋找靶基因，通過基因功能實驗驗證及確定其發(fā)揮作用的靶基因，明確靶基因在宮頸癌中的功能，最后利用宮頸相關組織樣本驗證JunD及靶基因的組織相關性，并比較分析JunD與靶基因的表達水平與宮頸不良預后病理參數(shù)的相關性。旨在尋找宮頸癌潛在的治療靶點，為探索中晚期宮頸癌的治療新策略提供證據(jù)。
　　第

4、一部分 JunD對宮頸癌細胞生物學行為的影響
　　目的:
　　明確JunD對宮頸癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學行為的調(diào)控作用。
　　方法:
　　采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR)法和westernblot檢測JunD在HPV陽性的宮頸癌細胞系和HPV陰性的細胞系的mRNA和蛋白水平。利用細胞轉(zhuǎn)染技術分別在宮頸癌細胞株SiHa和CaSki中轉(zhuǎn)染

5、JunD小干擾序列或陰性對照下調(diào)JunD的表達，在HPV陰性細胞株U2OS中轉(zhuǎn)染JunD表達質(zhì)?；蚩蛰d質(zhì)粒上調(diào)JunD的表達，分別通過CCK-8法檢測腫瘤細胞的增殖能力、流式細胞技術檢測細胞凋亡、Transwell聯(lián)合或不聯(lián)合matrigel實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力。
　　結(jié)果:
　　1.JunD在HPV陽性宮頸癌細胞株中的表達水平高于在HPV陰性細胞株的表達。
　　2.宮頸癌細胞株SiHa和CaSki中干擾Jun

6、D的表達能抑制腫瘤細胞的增殖能力，促進細胞早期凋亡，同時細胞的遷移和侵襲能力均受到明顯抑制。
　　3.HPV陰性細胞株U2OS中上調(diào)JunD的表達促進細胞增殖，抑制細胞早期凋亡，促進細胞侵襲和遷移。
　　結(jié)論:
　　1.在宮頸癌細胞中，JunD的表達促進細胞增殖、抑制凋亡、促進細胞的侵襲和遷移，提示JunD在宮頸癌進展過程中發(fā)揮促癌作用。
　　第二部分 JunD基因的生物信息學分析及靶基因的驗證
　　目的:

7、
　　尋找JunD發(fā)揮功能的靶基因，以揭示JunD參與宮頸癌進展的作用和分子機制。
　　方法:
　　對Oncomine數(shù)據(jù)庫內(nèi)臨床樣本數(shù)據(jù)集和細胞系數(shù)據(jù)集，進行共表達分析篩選可能存在的與JunD共表達的基因。結(jié)合BioGRID數(shù)據(jù)庫篩選可能存在的與JunD有蛋白相互作用關系的共表達分子。利用實時熒光定量PCR(quantitative real-timeRT-PCR，qRT-PCR)法對篩選得到的靶分子在HPV陽性的宮

8、頸癌細胞系和HPV陰性的細胞系檢測mRNA水平。利用小干擾技術調(diào)控JunD的表達，觀察靶分子的mRNA和蛋白水平的改變，利用免疫共沉淀技術檢測JunD與靶分子的關系。
　　結(jié)果:
　　1.通過Oncomine數(shù)據(jù)庫和BioGRID數(shù)據(jù)庫預測得到與JunD存在蛋白互作關系并在宮頸癌中共表達的分子。
　　2.在HPV陽性的宮頸癌細胞系和HPV陰性的細胞系檢測部分篩選得到的分子，預測得到靶分子SIRT1。
　　3.Ju

9、nD能與SIRT1結(jié)合并同向調(diào)控SIRT1的蛋白表達。
　　結(jié)論:
　　1.Oncomine數(shù)據(jù)庫是篩選功能相關目的基因的有效工具。
　　2.SIRT1受JunD轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，是JunD的直接靶基因。
　　第三部分 SIRT1對宮頸癌細胞生物學行為的影響
　　目的:
　　驗證靶基因SIRT1在宮頸癌中對細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學行為的影響。
　　方法:
　　利用細胞轉(zhuǎn)染技術在宮

10、頸癌細胞株SiHa中轉(zhuǎn)染SIRT1小干擾序列或陰性對照序列下調(diào)SIRT1的表達，分別通過CCK-8法檢測腫瘤細胞的增殖能力、流式細胞技術檢測細胞凋亡、Transwell聯(lián)合或不聯(lián)合matrigel實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力。實時熒光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR)法和western blot法檢測SIRT1的mRNA和蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1.在宮頸癌細胞株中，

11、干擾SIRT1的表達可抑制SiHa細胞的增殖，促進細胞早期凋亡、并抑制細胞的侵襲和遷移能力。
　　結(jié)論:
　　1.SIRT1高表達促進宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并抑制凋亡，提示SIRT1在宮頸癌進展過程中發(fā)揮與JunD類似的促癌作用。
　　第四部分 JunD與 SIRT1在宮頸組織中的表達及意義
　　目的:
　　觀察JunD和SIRT1在宮頸組織中的表達差異及與臨床不良預后因素間的相關性。
　　方

12、法:
　　采用免疫組織化學的方法檢測59例正常宮頸上皮組織標本、77例宮頸高級別病變、138例宮頸鱗癌組織中JunD和SIRT1的表達水平，根據(jù)收集的病例的臨床相關資料整理其病理信息，分析JunD和SIRT1的表達水平與宮頸癌臨床不良預后病理因素的相關性。
　　結(jié)果:
　　1.JunD和SIRT1在宮頸鱗癌中的表達水平高于高級別病變組和正常上皮組織組。
　　2.JunD高表達與FIGO分期、細胞分化程度、脈管浸潤