桑樹低溫誘導(dǎo)基因Wap25的克隆及植株轉(zhuǎn)化技術(shù)研究.pdf

1、桑樹是多年生落葉性木本植物,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇,形成了我國(guó)豐富的桑樹種質(zhì)資源,其中一些高抗凍性的桑樹資源,即使在-30℃的條件下也能正常生存,這些資源為桑樹抗寒育種提供了遺傳基礎(chǔ)。在此以前,對(duì)桑樹抗凍、抗寒性研究大多停留在抗性指標(biāo)的測(cè)定上,從未涉及到低溫逆境的分子水平和低溫響應(yīng)的研究領(lǐng)域。由于桑樹等木本植物的生活周期長(zhǎng),目前尚沒有足夠的遺傳群體進(jìn)行分析,特別是冷相關(guān)基因的克隆及調(diào)控方面的報(bào)道極為鮮見。本研究探討了不同桑樹品種對(duì)

2、低溫逆境的反應(yīng),克隆了低溫誘導(dǎo)的相關(guān)基因并進(jìn)行分析和轉(zhuǎn)化研究,為分子水平的桑樹遺傳改良和抗性育種奠定了一定基礎(chǔ)。主要研究如下:
　　 1.利用人工低溫馴化的方法從32個(gè)桑品種中篩選出5個(gè)抗寒性較強(qiáng)的品種。用枝條作插穗,發(fā)芽后在3℃-0℃的馴化條件下,蒙古桑表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗寒性。
　　 2.以蒙古桑嫁接苗為材料,取鵲口期桑芽經(jīng)3℃誘導(dǎo)48 h后,提取幼莖(不含莖頂)RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,利用RT-PCR技術(shù)獲得了1條68

3、1 bp的cDNA序列。利用生物信息學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)資源對(duì)獲得的cDNA及其推演蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明,該序列具有一個(gè)完整的編碼框(ORF),編碼226個(gè)氨基酸。該序列提交GenBank,收錄號(hào)為DQ104333。推演蛋白的推測(cè)pI值是5.32,分子量為25.3 kDa。由此將該蛋白命名為WAP25。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),推演蛋白226個(gè)氨基酸中,疏水性氨基酸占相當(dāng)大的比例,其中丙氨酸(A)35個(gè),占15.5％;賴氨酸(K)31個(gè),

4、占13.7％;谷氨酸(E)29個(gè),占12.8％。這3種氨基酸占總量(226個(gè))的42％。有11個(gè)氨基酸構(gòu)成的同感序列(T**KAKEKA*D/E)前后重復(fù)12次,這種多次重復(fù)正是植物胚胎后期富集蛋白(LEA3)的特征,WAP25屬于低溫誘導(dǎo)蛋白。另外,該蛋白N端區(qū)1-33位具有典型的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)特征,暗示W(wǎng)AP25屬于分泌型蛋白。
　　 3.將目的片段與原核表達(dá)載體pET-28a連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28/Wap25,轉(zhuǎn)化E.c

5、oli BL21后,在E.coli BL21中得到有效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳在28 kDa附近有一特異條帶,表明WAP25與pET-28a融合表達(dá)產(chǎn)物的大小與預(yù)測(cè)的一致,Western blotting檢測(cè)也得到了相同結(jié)果。4.將目的片段與植物表達(dá)載體pIG121-Hm構(gòu)建重組質(zhì)粒pIG121/Wap25,并轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404,獲得對(duì)4種抗生素(Kan、Hm、Str和Rif)有抗性的工程菌LBA4404/pIG12

6、1/Wap25,感染矮牽牛的葉盤后在部分個(gè)體中出現(xiàn)綠色芽,進(jìn)而分化出不定芽,60 d后獲得了34株抗Kan和Hm的組培苗。提取抗性苗基因組DNA,以此為模板進(jìn)行Wap25基因的PCR擴(kuò)增和Southern檢測(cè),在8株抗性苗中有4個(gè)為陽(yáng)性,初步表明Wap25基因已經(jīng)導(dǎo)入矮牽牛中,兩批的轉(zhuǎn)化率為11.48％。
　　 5.以菌株A-110(LBA4404/pIG121-Hm)為工程菌,用植株轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)真葉開放期的桑苗進(jìn)行了轉(zhuǎn)化研究。在