小麥TaWRKY基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，在時(shí)間和空間上協(xié)同控制植物基因的表達(dá)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的生物和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)、信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物衰老和器官發(fā)育等一系列生理活動(dòng)。本研究通過對禾谷鐮刀菌誘導(dǎo)處理感、抗赤霉病近等基因系材料Apogee和Apogee73S2，采集處理72 h及對照的穎殼，提取其總RNA構(gòu)建差異表達(dá)譜，獲得一個(gè)在抗病材料比感病材料表達(dá)豐度高的WRKY基因，設(shè)計(jì)WRKY基因的特異引物，克隆了該小麥TaWRK

2、Y基因。為研究此基因的功能，構(gòu)建了TaWRKY基因槍介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化載體。誘導(dǎo)普通小麥“科農(nóng)199”的幼胚愈傷7503個(gè)，用于基因槍介導(dǎo)TaWRKY基因的遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)Biolaphos篩選獲得抗性植株，再經(jīng)PCR檢測獲得陽性植株。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)小麥TaWRKY基因的克隆:克隆得到的TaWRKY基因，經(jīng)過序列比對和分析，其閱讀框?yàn)?21 bp，編碼206個(gè)氨基酸，TaWRKY蛋白含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2

3、型鋅指結(jié)構(gòu)，屬于Ⅱc類型WRKY轉(zhuǎn)錄因子。聚類分析顯示，該基因與烏拉爾圖一粒小麥的WRKY基因序列(EMS61070.1)相似度達(dá)97％。
　　(2)小麥TaWRKY基因表達(dá)載體的構(gòu)建:構(gòu)建完成的pUbi-WRKY表達(dá)載體，以克隆到的TaWRKY基因的質(zhì)粒DNA為模板擴(kuò)增出的目的基因片段連接到pUbi-KN1表達(dá)載體上。
　　(3)遺傳轉(zhuǎn)化:培養(yǎng)獲得“科農(nóng)199”的幼胚愈傷10270個(gè)，用基因槍轟擊轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pUbi-WR

4、KY的愈傷7503個(gè)。
　　(4)抗性篩選:得到分化愈傷5009，經(jīng)Biolaphos抗性篩選，最終獲得1400株再生植株，抗性苗率為27.94％。
　　(5) PCR檢測:再生植株中鑒定出8株陽性植株，轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定尚在進(jìn)行中。
　　在本研究中，我們克隆得到小麥的WRKY基因，初步分析了該基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。構(gòu)建了植物表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到普通小麥“科農(nóng)199”中，實(shí)現(xiàn)了小麥TaWRKY基因的遺