尿酸調控脂肪組織RAS及其與肥胖性高血壓的相關性.pdf

1、背景:
　　高血壓病是最常見的肥胖相關性疾病。肥胖性高血壓病因十分復雜,迄今尚未完全闡明。高尿酸血癥(Hyperuricemia, HUA)是肥胖患者常見的代謝紊亂狀態(tài)。近年來,有大量研究發(fā)現(xiàn),血尿酸與多種心血管疾病和代謝性疾病密切相關,如高血壓病、肥胖、2型糖尿病、代謝綜合征等。這些疾病中,血尿酸與高血壓發(fā)病機制之間的聯(lián)系引起研究者極大的興趣。盡管具體的機制尚不清楚,但來自流行病學、臨床試驗和動物實驗的數(shù)據(jù)表明,高尿酸血癥參與了

2、肥胖性高血壓的發(fā)病。
　　文獻報道,脂肪組織幾乎表達腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system, RAS)的全部組分[1]。動物實驗的研究數(shù)據(jù)表明,白色脂肪組織所表達的血管緊張素原(Angiotensinogen, AGT)和血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)是循環(huán)池RAS的重要來源,在機體血壓調控中發(fā)揮重要作用[2]。脂肪組織AGT缺乏的小鼠血漿AGT水平更低,收縮壓隨之降低[3]。

3、研究發(fā)現(xiàn),原發(fā)性高血壓患者血漿腎素濃度與血尿酸水平明顯正相關[4]。然而,血漿AGT濃度與血尿酸之間在肥胖的原發(fā)性高血壓患者中是否存在關聯(lián),目前尚不清楚。
　　迄今為止,研究者發(fā)現(xiàn)有多種因素與脂肪組織RAS的調控相關[5],包括機體的營養(yǎng)狀態(tài)、胰島素、糖皮質激素、游離脂肪酸、雄激素、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha, TNFα)以及環(huán)磷腺苷(Cyclic adenosine monophosp

4、hate, cAMP)等。體外實驗發(fā)現(xiàn),尿酸可以對幾種組織RAS發(fā)揮調控作用,包括永生化人系膜細胞(Immortalized human mesangial cells, ihMCs)組織RAS[6]、人血管內皮細胞(Human vascular endothelial cells, HVECS)組織RAS[7]、血管平滑肌細胞(Vascular smooth cells, VSMCs)組織RAS[8]。肥胖患者脂肪組織RAS處于過度活

5、躍狀態(tài)[9]。針對這種有趣的現(xiàn)象,最常見的解釋是:與體型正常的個體比較,肥胖患者體內脂肪含量明顯增多。研究發(fā)現(xiàn),尿酸與脂肪組織 RAS均在肥胖性高血壓發(fā)病中發(fā)揮重要作用,由此推斷,尿酸很可能對脂肪組織RAS表達也發(fā)揮調控作用。
　　眾所周知,肥胖性高血壓是一種氧化應激相關性心血管疾病[10]。多個研究證實,在一定條件下,尿酸可以誘導氧化應激發(fā)生。據(jù)報道[11],高濃度尿酸作用于3T3-L1脂肪細胞,可以明顯增加細胞內活性氧簇(Re

6、active oxygen species, ROS)水平。雖然發(fā)現(xiàn)尿酸是通過上調NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)活性誘導脂肪細胞氧化應激的,然而,研究者并未闡明尿酸增加NOX活性具體的分子機制。
　　針對以上問題,本課題嘗試通過體外實驗和臨床研究兩個層面進行深入探索。首先,利用3T3-L1脂肪細胞作為實驗模型,我們研究尿酸是否可以對脂肪組織RAS發(fā)揮調控作用。接下來,我們探討脂肪組織RAS激活在尿酸誘導的

7、氧化應激發(fā)病分子機制中的作用。最后,以324例未治療的原發(fā)性高血壓患者為研究對象,我們觀察血尿酸與血漿 AGT濃度是否存在關聯(lián),以及這種關聯(lián)是否因肥胖狀態(tài)而存在差異。以上研究將為闡明尿酸參與肥胖相關性心血管疾病(尤其是高血壓病)的發(fā)病機制提供新的視角。
　　方法:
　　1.以不同濃度的尿酸(0、1、5、15 mg/dl)作用未分化的前脂肪細胞48小時,或以高濃度尿酸(5、15 mg/dl)作用于分化第4天的3T3-L1脂肪細

8、胞48小時。實時RT-PCR檢測AGT mRNA水平。
　　2.不同濃度尿酸(0、1、5、15 mg/dl)作用于分化成熟的3T3-L1脂肪細胞48小時,或以15 mg/dl尿酸作用于成熟脂肪細胞不同時間(0、24、48、96小時)。部分細胞在15 mg/dl尿酸聯(lián)合2mM probenecid條件下孵育48小時。實時RT-PCR檢測脂肪組織RAS基因表達,酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme linked immunosorbent

9、assay, ELISA)檢測培養(yǎng)液AngⅡ的蛋白表達量。
　　3.成熟脂肪細胞在15 mg/dl尿酸聯(lián)合10-4 M氯沙坦或10-4 M卡托普利條件下孵育48小時。分別以實時RT-PCR和ELISA法檢測AGT mRNA水平和AngⅡ的蛋白分泌量。以比色法定量檢測NOX的酶活性。
　　4.成熟脂肪細胞以高濃度尿酸(5、15 mg/dl)干預48小時。另外,部分細胞在15 mg/dl尿酸聯(lián)合RAS抑制劑(10-4 M氯沙坦或

10、10-4 M卡托普利)條件下孵育,部分細胞在15 mg/dl尿酸聯(lián)合10mM N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)或200μM apocynin(一種NOX抑制劑)條件下孵育。熒光探針2',7'-二氯雙乙酸鹽(2′,7′- dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)或二氫羅丹明(Dihydrogen rhodamine123, DHR)或NBT法檢測細胞內活性氧含量。定性

11、檢測采用熒光顯微鏡,定量檢測采用熒光酶標儀。
　　5.臨床研究共納入162例未經治療的肥胖的男性高血壓患者,同期納入162例與之年齡相匹配的男性非肥胖高血壓患者。人體學指標由專門護士測量,包括血壓、身高、體重、腰圍、臀圍等。全自動生化分析儀檢測空腹血糖、血尿酸、血肌酐和血脂水平。空腹胰島素(Fasting insulin levels, FINS)水平以放射免疫法檢測。穩(wěn)態(tài)模型評估的胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis mode

12、l assessment of insulin resistance, HOMA-IR)用于衡量機體胰島素抵抗程度。血漿AGT濃度以ELISA法檢測。
　　6.肥胖高血壓組與非肥胖高血壓組組間指標比較采用獨立樣本t檢驗或卡方檢驗。肥胖高血壓組與非肥胖高血壓組按尿酸三分位數(shù)分別再劃分為三個亞組,采用單因素ANOVA進行組間比較,采用Bonferrroni’spost hoc檢驗進行兩兩比較。尿酸與其他參數(shù)的相關性采用偏相關分析(調整

13、年齡、吸煙史、飲酒史)。肥胖高血壓人群血尿酸對血漿 AGT水平的獨立影響以多元回歸模型進行分析與評估。統(tǒng)計分析采用SPSS17.0軟件,作圖采用GraphPad prism5.0軟件。
　　結果:
　　1.不同濃度的尿酸對未分化的前脂肪細胞AGT mRNA表達無明顯作用(P>0.05)。然而,高濃度尿酸(5、15 mg/dl)可以使分化中的3T3-L1脂肪細胞AGT mRNA表達明顯增加(均P<0.05)。
　　2.分

14、化成熟的脂肪細胞在生理濃度尿酸(1 mg/dl)作用下,AGT mRNA變化不明顯(P>0.05),但高濃度尿酸(5、15 mg/dl)作用可以使脂肪組織RAS基因表達和AngⅡ蛋白分泌量明顯上調(均P<0.05)。15 mg/dl尿酸作用于脂肪細胞24小時,AGT mRNA變化不明顯(P>0.05);作用48小時或96小時,AGT mRNA表達和AngⅡ蛋白產量明顯增加(均P<0.05)。而且,尿酸對脂肪RAS的調控作用具有濃度依賴性

15、和時間依賴性特點。另外,陰離子轉運子(Organic anion transporter, OAT)抑制劑probenecid可以明顯減弱尿酸對脂肪組織RAS的活化作用。
　　3.與單純高尿酸組(15 mg/dl)比較,10-4 M氯沙坦或10-4 M卡托普利聯(lián)合高尿酸組AGT mRNA和AngⅡ蛋白水平均明顯減少(均P<0.05)。并且,氯沙坦和卡托普利可以使高濃度尿酸激活的NOX酶活性顯著下降(均P<0.05)。
　　4

16、.高濃度尿酸(5、15 mg/dl)使脂肪細胞內ROS水平明顯增加(均P<0.05)。RAS抑制劑氯沙坦和卡托普利可以明顯減少高濃度尿酸作用下的脂肪細胞內 ROS水平(均P<0.05)。而且,抗氧化劑NAC或NOX抑制劑apocynin聯(lián)合高尿酸培養(yǎng)脂肪細胞,也能降低細胞內ROS水平(均P<0.05)。
　　5.肥胖高血壓患者腰圍、腰臀比和體重指數(shù)顯著升高。此外,與非肥胖高血壓患者比較,肥胖高血壓患者飲酒比例增高,甘油三酯、空腹血

17、糖、血尿酸、AGT、FINS、HOMA-IR及收縮壓升高(均P﹤0.05)。按尿酸三分位數(shù)將患者劃分為三個亞組,結果顯示,肥胖高血壓患者最高尿酸三分位數(shù)組(血尿酸435.9~642.2μmol/L)與最低尿酸三分位數(shù)組(血尿酸282.7~373.6μmol/L)比較,AGT(P﹤0.001)、FINS(P=0.002)、HOMA-IR(P=0.007)均明顯升高。然而,非肥胖高血壓患者組按尿酸三分位數(shù)劃分后,沒有發(fā)現(xiàn)類似差異(P>0.0

18、5)。
　　6.調整年齡、吸煙史、飲酒史后,偏相關分析結果顯示,肥胖高血壓患者血尿酸與AGT(r=0.437, P﹤0.001)、FINS(r=0.245, P=0.002)、HOMA-IR(r=0.237, P=0.003)明顯相關。然而,非肥胖高血壓患者血尿酸與 AGT、FINS以及 HOMA-IR無明顯相關性(P>0.05)。多元逐步回歸分析結果顯示,交互變量“肥胖×尿酸”獨立影響高血壓患者血漿AGT水平(β=0.257,

19、P﹤0.001)。
　　結論:
　　1.尿酸可以上調分化中和分化成熟的脂肪組織RAS表達,但對未分化的前脂肪細胞無此作用。尿酸必須通過尿酸鹽轉運子進入脂肪細胞內,才能發(fā)揮對脂肪組織RAS的調控作用。
　　2.脂肪組織RAS過度激活參與了尿酸誘導的氧化應激發(fā)病的分子機制:尿酸上調脂肪組織RAS,增加AngⅡ產生,繼而激活NOX活性、增加脂肪細胞內ROS水平,最終誘導氧化應激發(fā)生。
　　3.高血壓患者血尿酸水平與血漿