A20人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子真核載體的構(gòu)建及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景:
　　缺血性腦血管病已成為臨床上的常見病、多發(fā)病,致殘率、病死率及復(fù)發(fā)率均高。近年來(lái),影像學(xué)發(fā)展突飛猛進(jìn),血管內(nèi)介入治療腦血管病在臨床上廣泛開展,使缺血性腦血管病復(fù)發(fā)率、病死率顯著降低。但是由于經(jīng)皮血管成形術(shù)(percutaneous transluminal angioplasty PTA)如支架植入、球囊擴(kuò)張等導(dǎo)致血管狹窄部位局部損傷,引起血管過度修復(fù)反應(yīng),導(dǎo)致術(shù)后再狹窄成為了該項(xiàng)治療的發(fā)展的瓶頸。一項(xiàng)CREST試驗(yàn)研究

2、表明,頸動(dòng)脈支架術(shù)后,兩年內(nèi)再狹窄的發(fā)生率為6.0％,在吸煙、高血壓、高血脂及糖尿病患者發(fā)生率更高[1]。因此再狹窄防治不容忽視。在血管成形術(shù)后再狹窄的病理生理機(jī)制研究中,人們發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是這一系列病理過程的始動(dòng)因素[2],可以引起血管平滑肌細(xì)胞病理性增殖等系列改變。而炎癥反應(yīng)在內(nèi)皮損傷中起關(guān)鍵的作用[3]。因此,血管成形術(shù)以后炎癥反應(yīng)的防治成為了防治再狹窄的關(guān)鍵。
　　目前大量研究表明A20基因是內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)性基因,同

3、時(shí)具有抗炎作用[4-5],因此A20基因可能具有抑制再狹窄的作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)攜帶A20基因的血管內(nèi)支架能明顯改善支架術(shù)后再狹窄,說(shuō)明通過A20修飾可構(gòu)建具有抗再狹窄作用的血管內(nèi)支架[6]。但是支架直接攜帶目的基因存在著效率低、穩(wěn)定性差等問題。人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子(zinc finger–artificialtranscription factor ZF-ATF)技術(shù)能夠高效穩(wěn)定地誘導(dǎo)目的基因表達(dá)。本課題主要構(gòu)建A20基因ZF-ATF的

4、真核表達(dá)載體,啟動(dòng)內(nèi)源性A20基因的高水平表達(dá),研究其生物學(xué)功能,為最終構(gòu)建擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的ZF-ATF修飾的血管內(nèi)支架奠定基礎(chǔ)。
　　目的:
　　1.構(gòu)建A20基因的人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子(ZF-ATF)的真核表達(dá)載體。
　　2.觀察ZF-ATF轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)后對(duì)內(nèi)源性A20基因的表達(dá)調(diào)控及對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖、遷移能力的影

5、響。
　　3.研究人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子對(duì)LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響并探討其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　1.根據(jù)人A20基因ZF-ATF的序列,設(shè)計(jì)出其引物,以質(zhì)粒DNApUC19-ZF-ATF為模板,通過PCR擴(kuò)增出目的基因片段ZF-ATF,再通過BamHⅠ和KpnⅠ酶切后的載體連接產(chǎn)生ZF-ATF真核載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α,篩選陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒,限制性內(nèi)切酶酶切鑒定,鑒定陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

6、>　　2.ZF-ATF轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞,用含G418300μg/mL的1640培養(yǎng)液進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選。
　　3.通過Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染ZF-ATF后內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)源性A20蛋白的表達(dá)。
　　4.MTT實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染ZF-ATF后HUVEC細(xì)胞的增殖能力,transwells實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞遷移能力。
　　5.用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),利用Western blot檢測(cè)NF-κBp

7、65的表達(dá)情況,利用ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-8等。
　　6.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GrapPad Prism 5軟件處理,Mann-Whitney U檢驗(yàn)用于比較炎癥因子的差異。
　　結(jié)果:
　　1.通過限制性內(nèi)切酶酶切鑒定及DNA測(cè)序證實(shí)ATF插入正確,成功構(gòu)建A20人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子的真核表達(dá)載體。
　　2.ZF-ATF轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞,成功篩選出HUVEC細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)系,Western blot證實(shí)

8、ZF-ATF轉(zhuǎn)染HUVEC后內(nèi)源性A20蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01)。
　　3.ZF-ATF轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞后抑制了其增殖能力,增強(qiáng)了遷移能力。
　　4.ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明,LPS刺激前后,空載組及空白組細(xì)胞因子表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,LPS刺激后均明顯上調(diào)(空白組IL-6:126±28.8vs738±70.1,IL-8:110±33.9vs724±72.3,TNF-α:9.8±1.5vs41±8.9,P<0.05

9、;空載體組:IL-6:134±11.4vs712±110.3,IL-8:110±29.1vs762±10.6,TNF-α:7.6±2.3vs42±9.1P<0.05),ZF-ATF轉(zhuǎn)染組細(xì)胞因子也有明顯上調(diào)(IL-6:130±35.4vs292±44.9,IL-8:96±18.2vs328±76.3,TNF-α:7.2±2.6vs21±4.2P<0.05),但ZF-ATF轉(zhuǎn)染組細(xì)胞因子的上調(diào)水平?jīng)]有空白組及空載組上調(diào)水平高,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差

10、異(IL-8、IL-6P<0.01,TNF-αP<0.05),ZF-ATF轉(zhuǎn)染組與空白組比較細(xì)胞因子表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(IL-8、IL-6P<0.01,TNF-αP<0.05),而空載組與空白組比較LPS刺激前后細(xì)胞因子的表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Westernblot證實(shí)在LPS刺激后ZF-ATF轉(zhuǎn)染組NF-κBp65的表達(dá)(19.8±4.5)較空載組(90.2±5.9)及空白組(96.3±3.3)顯著下調(diào)(P<0.01)。