C反應蛋白對內(nèi)皮祖細胞功能的影響及其機制研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的：探討人外周血來源的內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)體外誘導培養(yǎng)和鑒定的方法，以期證實人外周血是基礎(chǔ)研究與臨床實踐的一個理想的內(nèi)皮祖細胞來源，并且建立一個內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)與鑒定有效的技術(shù)平臺。
　　 方法：密度梯度離心法獲取健康成年男性外周血單個核細胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMNCs)，接種在人纖維連接蛋

2、白預先包被的培養(yǎng)板培養(yǎng)，用EndoCultTM內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)，觀察內(nèi)皮祖細胞集落形成單位，收集貼壁細胞，根據(jù)內(nèi)皮祖細胞的特性，通過倒置熒光顯微鏡、流式細胞術(shù)、RT—PCR3種方法鑒定內(nèi)皮祖細胞。
　　 結(jié)果：從成人外周血分離獲得的PBMNCs經(jīng)體外誘導培養(yǎng)，可以形成內(nèi)皮祖細胞的早期集落形成單位，表達內(nèi)皮祖細胞的相塒特異性抗原，包括AC133、CD34和VEGFR—2，并顯示出具有能內(nèi)吞乙酰化低密度脂蛋白(acetyla

3、te low—densitylipoprotein，acLDL)和結(jié)合荊豆凝集素(ulex europaeus agglutinin—1 lectin，UEA—1lectin)的功能，同時可表達內(nèi)皮源型一氧化氮合酶基因(endothelial nitric oxidesynthase，eNOS)，所誘導培養(yǎng)的細胞具有內(nèi)皮祖細胞的特征，鑒定為內(nèi)皮祖細胞。
　　 結(jié)論：通過EndoCultTM內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)基及其標準操作流程可以在人

4、外周血中誘導培養(yǎng)EPCs，培養(yǎng)出的EPCs可表達內(nèi)皮祖細胞相對特異性抗原，包括AC133、CD34和VEGFR—2及具有內(nèi)皮細胞的內(nèi)吞乙?；兔芏戎鞍缀徒Y(jié)合荊豆凝集素，以及eNOS基因表達的功能。eNOS基因表達的檢測或可簡化EPCs的鑒定。我們的實驗為EPCs的分離鑒定方法提供了借鑒。
　　 第二部分：
　　 目的：血管內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮細胞的前

5、體細胞，不儀參與胚胎血管生成，也參與出生后的血管生發(fā)過程。C反應蛋白(C—reactive protein，CRP)最初被認為只是一種炎癥標志物，并不直接參與炎癥反應過程，但新近的證據(jù)證實在粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中，CRP可能參與了這一慢性炎癥損傷過程。白細胞介素8(Interleukin—8，IL—8)是由內(nèi)皮祖細胞分泌的一個重要的促血管新生因子。本研究旨在探討C反應蛋白對內(nèi)皮祖細胞IL—8表達的影響并探討其可能的機制。

6、r>　　 方法：以不同濃度(5～25μg/ml))人重組C反應蛋白及不同時間段(3～48 hours)刺激人外周血分離培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細胞，檢測其培養(yǎng)液上清IL—8因子的水平和細胞IL—8mRNA的水平?？笴D16、CD32抗體和P38—MAPK信號通路抑制劑預處理內(nèi)皮祖細胞后，再檢測CRP對其IL—8表達水平的影響。
　　 結(jié)果：不同濃度的CRP加入到EPCs培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞12 hours后，real—time PC

7、R和ELISA檢測IL—8的表達水平，結(jié)果顯示CRP能抑制EPCs IL—8的表達，并且這一效應與CRP濃度相關(guān)，10μg/ml的CRP即可顯著抑制IL—8的表達，25μg/ml濃度的CRP作用更強；P38—MAPK信號通路抑制劑SB203580及抗CD32抗體預處理可以部分阻斷CRP對內(nèi)皮祖細胞抑制IL—8分泌的作用；而抗CD16抗體預處理內(nèi)皮祖細胞則無此作用。
　　 結(jié)論：C反應蛋白直接抑制內(nèi)皮祖細胞IL—8的表達，CD32