藥物修飾內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮修復(fù)及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的： 預(yù)防和治療再狹窄是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。再狹窄形成的始動(dòng)因素是內(nèi)皮損傷和剝脫，然而成熟內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)能力有限，而近來(lái)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是進(jìn)行內(nèi)皮修復(fù)的種子細(xì)胞。由于EPCs在疾病狀態(tài)或冠心病危險(xiǎn)因素存在時(shí)，數(shù)量不但減少，而且存在功能低下。 第一部分：高膽固醇血癥兔外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)特性及相關(guān)機(jī)制的研究 材料與方法： 12只雄性新西蘭大白兔分為2組：正常組和高膽固醇血癥組。從兔耳中央動(dòng)脈抽取

2、的血按密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，EBM-2培養(yǎng)基(含20％胎牛血清，EGM-2MVSingLeQuots)培養(yǎng)3-4周。采用雙熒光染色法、流式鑒定和免疫組化鑒定細(xì)胞為EPCs。MTT法、黏附能力檢測(cè)和Griess法測(cè)定細(xì)胞增殖、黏附、分泌一氧化氮(NO)的能力。比色法測(cè)定細(xì)胞超氧陰離子(O2-)的濃度、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)和NADPH氧化酶的活性。RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞eNOS和NADPH氧化酶p22phox的mRNA表

3、達(dá)。 結(jié)果： 細(xì)胞流式儀發(fā)現(xiàn)體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)CD34，免疫組化法進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該類(lèi)細(xì)胞還可表達(dá)內(nèi)皮系特異標(biāo)志vWF；同時(shí)該類(lèi)細(xì)胞也能攝取ac-LDL和結(jié)合UEA-1，提示本實(shí)驗(yàn)已成功分離和體外培養(yǎng)出兔外周血EPCs。 結(jié)論： 高膽固醇血癥時(shí)EPCs的數(shù)量減少和功能(增殖、遷移和分泌)受損；氧化應(yīng)激參與影響其數(shù)量和功能。 第二部分：羅格列酮和阿托伐他汀對(duì)兔內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的影響 材料

4、與方法：動(dòng)物分組、EPCs的鑒定和培養(yǎng)同第一部分實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果： 1.0.01μM至1μM濃度時(shí)，羅格列酮呈濃度依賴性提高高膽固醇血癥兔EPCs的數(shù)量、增殖、黏附和分泌VEGF及NO功能。而10μM羅格列酮未進(jìn)一步提高EPCs數(shù)量和功能。 2.0.01μM至1μM濃度時(shí)，阿托伐他汀呈濃度依賴性提高高膽固醇血癥兔EPCs的數(shù)量、增殖、黏附和分泌VEGF及NO功能。而10μM阿托伐他汀未進(jìn)一步提高EPCs數(shù)量和功能。

5、 3.1μM羅格列酮聯(lián)合1μM阿托伐他汀組，較1μM阿托伐他汀和1μM羅格列酮更進(jìn)一步提高EPCs的數(shù)量(50.50±4.04vs45.98±5.08，44.08±3.70，P＜0.05)和功能(增殖：0.61±0.02vs0.52±0.03和0.50±0.03，P＜0.05；黏附：40.67±2.08vs30.67±1.53和30.67±0.58，P＜0.05；分泌：VEGF,120.76±12.59vs88.10±12.52和

6、84.25±13.75，P＜0.05)，對(duì)分泌NO功能雖無(wú)顯著進(jìn)一步增強(qiáng)(24.74±4.27vs18.16±1.70和15.05±2.85，P＞0.05)，但有增加的趨勢(shì)。 4.1μM阿托伐他汀和1μM羅格列酮均可分別使高膽固醇血癥組eNOS表達(dá)增加60％和23％。兩者聯(lián)合干預(yù)則使表達(dá)增加94％，較單藥增加更為明顯(P＜0.05)，且與正常組無(wú)差異(P＞0.05)。 結(jié)論： 羅格列酮聯(lián)合阿托伐他汀可協(xié)同提高EP

7、Cs數(shù)量和改善功能，實(shí)現(xiàn)體外對(duì)EPCs進(jìn)行“藥物修飾”。 第三部分：羅格列酮聯(lián)合阿托伐他汀修飾內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)內(nèi)皮修復(fù)的研究 材料與方法： 25只雄性新西蘭大白兔隨機(jī)分為4組：正常組(N，n=10)、損傷未干預(yù)組(C，n=8)、EPCs移植組(E，n=8)和藥物干預(yù)EPCs移植組(ME，n=8)。藥物干預(yù)EPCs指EPCs經(jīng)1μM羅格列酮聯(lián)合1μM阿托伐他汀預(yù)處理24小時(shí)。 結(jié)果： 1.EPCs移

8、植組和藥物干預(yù)EPCs移植組在熒光顯微鏡下均發(fā)現(xiàn)損傷部位有Dil標(biāo)記的移植的EPCs。而正常組與損傷未干預(yù)組未見(jiàn)熒光細(xì)胞表達(dá)。表明EPCs歸巢于受損血管處。 2.EPCs移植組的再內(nèi)皮化率較未損傷干預(yù)組顯著提高(75.57±4.03％vs51.66±1.69.P＜0.05％)，而藥物干預(yù)組則進(jìn)一步提高(93.38±2.41％vs75.57±4.03％，P＜0.05)。 3.與正常組相比，損傷未干預(yù)組I/M顯著升高(1.8

9、0±0.16vs0.28±0.03，P＜0.05)；EPCs移植組I/M較損傷未干預(yù)組顯著降低(1.31±0.22vs1.80±0.16，P＜0.05)；而藥物干預(yù)EPCs移植組則使I/M進(jìn)一步降低(0.51±0.08vs1.31±0.22，P＜0.05)。 4.與正常組相比，未損傷干預(yù)組α-SMA表達(dá)顯著增加，EPCs移植組使α-SMA表達(dá)下降，而藥物干預(yù)EPCs移植組則進(jìn)一步下降。 結(jié)論： EPCs移植可以定

10、位于頸動(dòng)脈損傷段，加速內(nèi)皮修復(fù)，抑制內(nèi)膜增生，延緩再狹窄。藥物修飾EPCs移植可進(jìn)一步加速再內(nèi)皮化，提高抑制內(nèi)膜增生療效和防治再狹窄。 第四部分：羅格列酮和阿托伐他汀動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮修復(fù)的影響及相關(guān)機(jī)制的研究 材料與方法： 40只雄性新西蘭大白兔隨機(jī)分為5組：正常組(n=8)、損傷未干預(yù)組(n=8)、羅格列酮組(n=8，1mg/kg/d)、阿托伐他汀組(n=8，5mg/kg/d)和羅格列酮聯(lián)合阿托伐他汀組(n

11、=8，1mg/kg/d羅格列酮和5mg/kg/d阿托伐他汀)。除了正常組均于高脂飲食2周后行頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)(同第三部分實(shí)驗(yàn))，術(shù)后繼續(xù)高脂飲食；正常組僅切開(kāi)頸部皮膚，給予正常飼料，均共4周。術(shù)后4周末用流式細(xì)胞儀測(cè)量外周血中CD34和KDR雙陽(yáng)性的細(xì)胞為循環(huán)EPCs。生化法檢測(cè)TC、TG、LDL-C、HDL-C和空腹血糖(Glu)。Griess法測(cè)定NO濃度，比色法測(cè)定血管壁O2-。行伊文氏藍(lán)染色，計(jì)算內(nèi)皮再生面積與損傷總面積比(An

12、/At)評(píng)價(jià)再內(nèi)皮化率；行蘇木素-伊紅染色，計(jì)算內(nèi)膜與中膜比值(I/M)；免疫組化檢測(cè)血管壁α-SMA表達(dá)。掃描電鏡觀察血管壁的內(nèi)皮修復(fù)情況。RT-PCR法檢測(cè)血管壁eNOS和NADPH氧化酶p22phox的mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1.羅格列酮組服藥后TC、LDL、TG、HDL和Glu不受影響。阿托伐他汀組的TC和LDL較損傷未干預(yù)組明顯下降(P＜0.05)，但TG、HDL和Glu無(wú)明顯改變(P＞0.05)。羅格列酮聯(lián)合

13、阿托伐他汀組TC和LDL較損傷未干預(yù)組和羅格列酮組顯著降低(P＜0.05)，但降低水平與阿托伐他汀組無(wú)差別(P＞0.05)，其對(duì)TG、HDL和血糖也無(wú)影響。 2.損傷未干預(yù)組的EPCs數(shù)量較正常組降低了40％；羅格列酮組和阿托伐他汀組均使EPCs數(shù)量升高，分別增加了57％和65％，且與正常組無(wú)差異(P＞0.05)；藥物聯(lián)合組則使EPCs數(shù)量進(jìn)一步提高，增加了1倍(P＜0.05)。 3.正常組內(nèi)皮細(xì)胞完整覆蓋內(nèi)膜，沿著血流

14、方向排列；損傷未干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞大片剝脫；羅格列酮組和阿托伐他汀組仍有少許內(nèi)皮剝脫，但較損傷未干預(yù)組少；羅格列酮聯(lián)合阿托伐他汀組則內(nèi)皮覆蓋完全，但內(nèi)皮細(xì)胞排列較正常組紊亂。 4.與正常組相比，損傷未干預(yù)組I/M顯著增高(0.28±0.03vs1.80±0.16，P＜0.05)，提示內(nèi)膜增生形成；與損傷未干預(yù)組比較，羅格列酮組I/M顯著降低(1.80±0.16vs0.57±0.03，P＜0.05)；阿托伐他汀組也使I/M降低(1.8

15、0±0.16vs0.51±0.06，P＜0.05)；而聯(lián)合藥物治療后，使I/M降至正常水平(0.28±0.03vs0.37±0.06，P＞0.05)。 5.與正常組相比，未損傷干預(yù)組α-SMA表達(dá)顯著增加；羅格列酮組和阿托伐他汀組均分別使α-SMA表達(dá)下降，而藥物聯(lián)合干預(yù)組則使α-SMA進(jìn)一步下降。 6.損傷未干預(yù)組較正常組血清NO水平降低83％(P＜0.05)，羅格列酮組和阿托伐他汀組NO水平分別較損傷未干預(yù)組升高了3

16、0％和38％，羅格列酮聯(lián)合阿托伐他汀組使NO進(jìn)一步升高了62％，但仍低于正常組水平(P＜0.05)。損傷未干預(yù)組抗超氧陰離子(O2-)能力較正常組下降了約1.7倍；羅格列酮使其抗O2-能力提高了1倍(P＜0.05)；阿托伐他汀組則提高了87％(P＜0.05)；兩藥聯(lián)合提高了1.5倍(P＜0.05)，且與正常組無(wú)差別。 7.損傷未干預(yù)組eNOS的mRNA表達(dá)較正常組明顯降低(P＜0.05)；羅格列酮組和阿托伐他汀組均分別使損傷未干

17、預(yù)組eNOS的mRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)；藥物聯(lián)合治療后，eNOS的mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高，但未回復(fù)正常。相反，NADPHp22phoxmRNA在損傷未干預(yù)組呈明顯高表達(dá)，較正常組升高了1倍(P＜0.05)，羅格列酮組和阿托伐他汀組均使損傷未干預(yù)組表達(dá)下降(P＜0.05)。羅格列酮聯(lián)合阿托伐他汀組也使損傷未干預(yù)組NADPHp22phoxmRNA表達(dá)顯著降低，且降至正常水平。 結(jié)論： 羅格列酮在體內(nèi)動(dòng)員EPCs，是不