內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員與移植促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)預(yù)防再狹窄及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、1.背景： 再狹窄是介入心臟病學(xué)所面臨的巨大挑戰(zhàn)，其主要病理特征為新內(nèi)膜形成，而始動(dòng)因素則為內(nèi)皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮損傷和修復(fù)與再狹窄密切相關(guān)，內(nèi)皮修復(fù)可能成為再狹窄預(yù)防的下一靶標(biāo)。近年來發(fā)現(xiàn)他汀類藥物除降脂作用外，還能有效抑制再狹窄，且該效應(yīng)常伴有內(nèi)皮修復(fù)加速與內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)動(dòng)員，但他汀類藥物的防再狹窄效應(yīng)與內(nèi)皮修復(fù)及血液中EPCs水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性目前報(bào)道甚少，他汀類藥物在增加外周血EPCs數(shù)量的同時(shí)是否同時(shí)增強(qiáng)其增殖、黏

2、附和遷移功能也不明確，除動(dòng)員外他汀類藥物可否促進(jìn)球囊損傷局部血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)VEGF以引導(dǎo)EPCs歸巢，目前尚未見報(bào)道。 目的： 觀察阿托伐他汀防再狹窄效應(yīng)與再內(nèi)皮化率的相關(guān)性，探討相關(guān)機(jī)制是否涉及增加外周血EPCs數(shù)量，增強(qiáng)其增殖、黏附、遷移功能，以及促進(jìn)球囊損傷局部血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)VEGF以引導(dǎo)EPCs歸巢。 方法： 40只SD大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、損傷未干預(yù)組、損傷即時(shí)處死組和阿樂組。后三組行

3、頸總動(dòng)脈球囊損傷造模，其中損傷即時(shí)處死組僅用于確認(rèn)內(nèi)皮剝脫的完全性。除損傷未干預(yù)組外，各組均于1周時(shí)取血5毫升，分離單個(gè)核細(xì)胞，M199培養(yǎng)基培養(yǎng)成內(nèi)皮祖細(xì)胞并行Dil-acLDL和FITC-UEA-1雙標(biāo)鑒定，檢測(cè)各組大鼠EPCs的數(shù)量與增殖、黏附、遷移功能。4周后所有動(dòng)物處死取損傷段血管，彈力染色并計(jì)算內(nèi)膜、中膜面積比值I/M以評(píng)價(jià)再狹窄程度，伊文氏蘭染色并計(jì)算再生內(nèi)皮面積、總面積比值A(chǔ)n/At以評(píng)價(jià)再內(nèi)皮化率，免疫組化與RT-PC

4、R分別檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的蛋白與mRNA表達(dá)。 結(jié)論： 阿托伐他汀預(yù)防再狹窄效應(yīng)與內(nèi)皮修復(fù)有關(guān)，其促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)的機(jī)制可能涉及增加外周血EPCs數(shù)量，增強(qiáng)其增殖、黏附、遷移功能，以及促進(jìn)球囊損傷局部血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)VEGF以引導(dǎo)EPCs歸巢。 2.背景： 越來越多的研究提示內(nèi)皮損傷與修復(fù)可能與再狹窄密切相關(guān)，內(nèi)皮修復(fù)可能成為再狹窄預(yù)防的下一靶標(biāo)。阿托伐他汀與粒細(xì)胞集落刺激因子G-CSF皆能動(dòng)

5、員內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，但它們的作用特點(diǎn)及療效機(jī)制可能不盡相同，從而提示二者聯(lián)合用藥在動(dòng)員EPCs修復(fù)內(nèi)皮預(yù)防再狹窄方面可能較單一用藥具有更好的療效。鑒于他汀類藥物防臨床再狹窄療效的有限性，探討預(yù)防再狹窄的新藥及相關(guān)聯(lián)合用藥具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。 目的： 觀察粒細(xì)胞集落刺激因子在動(dòng)員EPCs、加速內(nèi)皮修復(fù)和預(yù)防再狹窄方面與阿托伐他汀的差別，以及二者聯(lián)合用藥的療效。 方法： 50只SD大鼠數(shù)字隨機(jī)法均分為假

6、手術(shù)組、損傷未干預(yù)組、阿樂組、G-CSF組及阿樂與G-CSF聯(lián)合用藥組(簡(jiǎn)稱聯(lián)合組)，除假手術(shù)組外各組行頸總動(dòng)脈球囊損傷造模。各組均于1周時(shí)取血5毫升并分離單個(gè)核細(xì)胞，M199培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢測(cè)各組大鼠EPCs的數(shù)量與增殖、黏附、遷移功能。4周后所有動(dòng)物處死取損傷段血管，彈力染色并計(jì)算內(nèi)膜、中膜面積比值I/M以評(píng)價(jià)再狹窄程度，伊文氏蘭染色并計(jì)算再生內(nèi)皮面積、總面積比值A(chǔ)n/At以評(píng)價(jià)再內(nèi)皮化率，免疫組化與RT-PCR分別檢測(cè)受損動(dòng)脈局部血

7、管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的蛋白與mRNA表達(dá)。 結(jié)論： G-CSF可通過動(dòng)員EPCs加速內(nèi)皮修復(fù)從而預(yù)防再狹窄，其機(jī)制涉及增加外周血EPCs的數(shù)量，增中膜及新生內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)，無促進(jìn)EPCs向損傷血管強(qiáng)EPCs的增殖、黏附與遷移功能；與阿托伐他汀不同，G-CSF不增強(qiáng)損傷處局部歸巢的作用；與防再狹窄效果相當(dāng)?shù)腉-CSF對(duì)比，阿樂組再內(nèi)皮化率較低，提示阿托伐他汀防再狹窄效應(yīng)可能還涉及除內(nèi)皮修復(fù)以外的

8、其他機(jī)制G-CSF與阿托伐他汀聯(lián)合用藥在動(dòng)員EPCs、加速內(nèi)皮修復(fù)與預(yù)防再狹窄方面較單一用藥具有更好的療效。 3.背景： 再狹窄的主要病理特征為新內(nèi)膜形成，其始動(dòng)因素則為內(nèi)皮細(xì)胞受損，促進(jìn)損傷血管的再內(nèi)皮化可能對(duì)再狹窄的形成有抑制作用。由于內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)參與損傷血管的再內(nèi)皮化，動(dòng)員或自體移植EPCs對(duì)于再狹窄防治具有重要意義。目前已有不少有關(guān)G-CSF等EPCs動(dòng)員劑促進(jìn)再內(nèi)皮化預(yù)防再狹窄的報(bào)道，而EPCs體外擴(kuò)

9、增后自體移植方面的報(bào)道國(guó)內(nèi)外目前尚不多見；基于他汀類藥物預(yù)處理能改善EPCs的增殖、黏附和遷移等功能，阿托伐他汀預(yù)處理EPCs自體移植可能有更好的加速內(nèi)皮修復(fù)抑制再狹窄的效果，該方面的研究目前尚未見報(bào)道。 目的： 以單純EPCs自體移植作對(duì)照，觀察EPCs經(jīng)阿托伐他汀預(yù)處理后自體移植可否獲得更好的加速內(nèi)皮修復(fù)和預(yù)防再狹窄的療效。 方法： 共50只雄性SD大鼠納入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)均分為假手術(shù)組(與實(shí)驗(yàn)第一部分共用

10、)、損傷未干預(yù)組(與實(shí)驗(yàn)第一部分共用)、EPCs移植組、EPCs移植1周后處死組和阿托伐他汀預(yù)處理EPCs移植組。后4組行頸總動(dòng)脈球囊損傷造模。三個(gè)移植組均于造模前3周時(shí)取血5毫升，分離單個(gè)核細(xì)胞，M199培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代3周，移植前行EPCs鑒定，其中移植1周后處死組在移植前1天以Brdu標(biāo)記EPCs，以備1周后取血管損傷段行Brdu免疫熒光檢測(cè)。各移植組在球囊損傷后即予尾靜脈注射1×10<'6>個(gè)EPCs自體移植。4周后所有動(dòng)物處死取

11、損傷段血管，彈力染色并計(jì)算內(nèi)膜、中膜面積比值I/M以評(píng)價(jià)再狹窄程度，伊文氏蘭染色并計(jì)算再生內(nèi)皮面積、總面積比值A(chǔ)n/At以評(píng)價(jià)再內(nèi)皮化率。 結(jié)論： EPCs體外擴(kuò)增自體移植可通過加速再內(nèi)皮化而預(yù)防再狹窄；經(jīng)阿托伐他汀預(yù)處理EPCs加速再內(nèi)皮化和預(yù)防再狹窄的作用進(jìn)一步增強(qiáng)． 4.背景： 冠心病的本質(zhì)為血管病變，再狹窄的原發(fā)病因?yàn)榍蚰覔p傷，皆與內(nèi)皮損傷和功能障礙關(guān)系密切；循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)可參與內(nèi)皮修

12、復(fù)，與內(nèi)皮功能密切相關(guān)，在冠心病與再狹窄的發(fā)生、發(fā)展中可能扮演重要角色。不少研究發(fā)現(xiàn)冠心病接受PCI的患者接受他汀類藥物治療獲益的同時(shí)伴有EPCs數(shù)量與功能的改善，但要明確該效應(yīng)是否屬于他汀藥物降脂，抗炎等作用的伴隨現(xiàn)象，并探討他汀類藥物對(duì)EPCs作用的信號(hào)通路機(jī)制，需要在體外條件下觀察他汀對(duì)EPCs的直接作用，目前該方面的報(bào)道國(guó)內(nèi)外尚不多見。本研究觀察了冠心病患者與同齡非冠心病人相比其外周血來源EPCs數(shù)量與功能的變化特點(diǎn)，探討不同濃

13、度阿托伐他汀對(duì)冠心病患者外周血來源EPCs數(shù)量和增殖，黏附，遷移等功能的影響，以及這些作用與PI3/Akt和ERK信號(hào)通道的相關(guān)性。 目的： 觀察冠心病患者與同齡非冠心病人相比其外周血來源EPCs數(shù)量與增殖、黏附、遷移功能的變化特點(diǎn)，探討體外條件下不同濃度阿托伐他汀對(duì)冠心病患者外周血來源EPCs數(shù)量和增殖，黏附，遷移等功能的影響，以及這些作用與PI3/Akt和ERK信號(hào)通道的相關(guān)性。 方法： 冠心病患者和

14、非冠心病人各21例納入實(shí)驗(yàn)，分離其外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)成EPCs，其中每組各5例的外周血來源EPCs僅用于檢測(cè)VEGFR2、CD34和ACl33三種表型的表達(dá)，余16例冠心病人的外周血單個(gè)核細(xì)胞均分為6份，隨機(jī)納入以下6組：冠心病組、0.1μM阿托伐他汀組、1μM阿托伐他汀組、10μM阿托伐他汀組、10μM阿托伐他汀加10μM LY 294002(PI3/Akt通道阻斷劑)組和10μM阿托伐他汀加10μM PD 98059(ERK通道阻

15、斷劑)組，16例非冠心病人的外周血單個(gè)核細(xì)胞納入非冠心病組。各組外周血單個(gè)核細(xì)胞以M199培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼以Dil-acLDL和FITC-UEA-1雙染熒光鑒定其為EPCs；觀察冠心病患者外周血來源EPCs數(shù)量與功能與非冠心病人的差別，不同濃度阿托伐他汀對(duì)冠心病患者外周血來源EPCs數(shù)量和增殖、黏附、遷移功能的改善，以及阿托伐他汀對(duì)EPCs作用所依賴的信號(hào)通道。 結(jié)論： 阿托伐他汀呈濃度依賴性提高冠心病患者EPCs的數(shù)量與