沙門氏菌快速檢測體系的建立與應(yīng)用及其耐藥性分析研究.pdf

1、本研究成功建立了沙門氏菌快速檢測體系，包括斑點免疫金滲濾法、免疫金試紙條法、PCR快速檢測法和熒光定量PCR檢測法，對一系列反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，建立了相應(yīng)的檢測試劑盒，并已應(yīng)用于日常檢測和廈門市畜禽產(chǎn)品中沙門氏菌污染狀況的調(diào)查，檢測時間從常規(guī)法的4-5天縮短為2天，大大加快了沙門氏菌的檢測速度。同時對分離的沙門氏菌進行了藥敏試驗和耐藥程度分析，以了解沙門氏菌當(dāng)前的耐藥情況，建立了多重PCR方法同時檢測四環(huán)素二種耐藥基因，從分子水平了解沙

2、門氏菌的耐藥情況?，F(xiàn)將所做工作如下： 1、沙門氏菌快速檢測試紙條的研制與應(yīng)用。應(yīng)用提純的兔抗沙門氏菌抗體包被硝酸纖維素膜檢測線，羊抗兔IgG包被對照線，然后用膠體金標記純化的兔抗沙門氏菌抗體建立了檢測沙門氏菌的快速檢測試紙條。該法通過膠體金標記兔抗沙門氏菌抗體直接顯色，陽性者檢測線出現(xiàn)紅色線，整個試驗過程僅需10～15min即可判斷結(jié)果。與大腸桿菌、枸櫞酸桿菌、變形桿菌、陰溝腸桿菌等常見腸道菌不發(fā)生交叉反應(yīng)。與沙門氏菌的最低檢測

3、量為2.3x10<'5> cfu/ml，且檢測時間從國標法的4～5天縮短到2天，并與國標法的符合率達到100％。將試紙條4℃或37℃存放9個月，檢測結(jié)果無差異。整個操作過程不到1分鐘，比斑點免疫金滲濾法更為簡便，實驗結(jié)果更加直觀，肉眼即可判斷，且可以保存。非常適合廣大養(yǎng)殖戶、基層檢疫部門和突發(fā)中毒事件時使用。 2、斑點免疫金滲濾法檢測沙門氏菌的研制與應(yīng)用。首先將制備的兔抗沙門氏菌抗體用與之出現(xiàn)交叉反應(yīng)的大腸桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌、

4、奇異變形桿菌和陰溝桿菌等進行吸附，然后離心，取上清液用Protein A Sepharose TMCL-4B柱進行純化，測的蛋白含量為3.84mg/mL。然后用膠體金標記純化的兔抗沙門氏菌抗體，SPA(金黃色葡萄球菌A蛋白)包被硝酸纖維素膜作對照點，用沙門氏菌標準菌株進行反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立直接檢測沙門氏菌的斑點免疫金滲濾法(DIGFA)檢測試紙盒。整個試驗過程僅需10～15分鐘即可判斷結(jié)果，操作簡單，無需特殊儀器設(shè)備，陽性者出現(xiàn)紅色斑

5、點，結(jié)果易于判斷，與大腸桿菌、枸櫞酸桿菌、變形桿菌和綠膿桿菌等不發(fā)生交叉反應(yīng)。與沙門氏菌的最低檢測量為4.5x10<'6>cfu/mL，同時將該法與國標法檢測效果比較，檢測時間從4～5天縮短到2天，符合率達100％。將膠體金標記的兔抗沙門氏菌抗體凍干粉4℃存放12個月，檢測結(jié)果無差異。該方法非常適合基層普查使用。 3、沙門氏菌PCR快速檢測試劑盒的研制與應(yīng)用。根據(jù)沙門氏菌屬高度保守的菌毛fimY基因序列設(shè)計了一對引物，建立了用于

6、檢測沙門氏菌的PCR方法。對收集的A-F群標準菌株和臨床分離的60株沙門氏菌分離株和11種非沙門氏菌菌株進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用1.8％瓊脂糖電泳進行觀察，結(jié)果所有沙門氏菌均擴增出526bp的特異性條帶，而非沙門氏菌菌株未擴增出任何條帶。通過電泳判定結(jié)果，該法可檢出擴增體系中93cfu的沙門氏菌，還可檢出含3cfu沙門氏菌的樣品用BP預(yù)增菌或用MM增菌后的菌液。而且該試劑穩(wěn)定性良好，冷凍至少能保存12個月。說明該方法敏感性高、特異性強

7、、穩(wěn)定性好。采用直接菌體加入法、熱裂解、反復(fù)凍融、CTAB堿裂解法和柱式試劑盒提取法分別提取核酸模板，結(jié)果CTAB法效果最好，但操作煩瑣，而直接菌體加入法和熱裂解法可以達到和柱式試劑盒同樣的效果，且操作簡便快速、經(jīng)濟、效果好，值得推廣應(yīng)用。本研究為沙門氏菌屬的檢測提供了簡潔、敏感、特異的新方法。也可以作為斑點免疫金滲濾法和免疫金試紙條法的確認方法。 4、沙門氏菌實時熒光定量PCR快速檢測試劑盒的研制與應(yīng)用。根據(jù)沙門氏菌屬高度保守

8、的菌毛fimY基因序列設(shè)計了一對引物和TaqMan探針，建立了用于檢測沙門氏菌的實時熒光定量PCR方法，并對反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，組裝成快速檢測試劑盒，其檢測靈敏度達到4.5cfu，比常規(guī)PCR高100倍，而且穩(wěn)定性艮好，冷凍至少可以保存9個月，而與其它非沙門氏菌不存在交叉反應(yīng)。特別適合有條件的檢疫部門開展大量樣品的檢測。 5、沙門氏菌快速檢測系列方法的應(yīng)用。將建立的四種檢測方法用于廈門市畜禽產(chǎn)品中沙門氏菌污染情況的調(diào)查。通過近三

9、年調(diào)查，廈門市畜禽產(chǎn)品等沙門氏菌污染率為1.72％(81/4705)，其中超市銷售的畜禽產(chǎn)品總體狀況良好，污染率為0.43％(9/2350)。廈門地區(qū)生豬養(yǎng)殖場部分豬場(26.7％)、農(nóng)貿(mào)市場銷售的豬產(chǎn)品(9.33％)和現(xiàn)場屠宰的禽類(2.67％)以及原高崎肉聯(lián)廠屠宰生豬(10％)沙門氏菌污染較為嚴重，應(yīng)加強管理，特別應(yīng)加強消毒清潔工作。 6、多重PCR技術(shù)同時檢測沙門氏菌四環(huán)素二種耐藥基因方法的建立和應(yīng)用。根據(jù)質(zhì)粒pRT11和

10、質(zhì)粒pBR322中相應(yīng)的四環(huán)素耐藥基因-TetB和TetC的基因序列設(shè)計了兩對特異性引物，建立了同時檢測四環(huán)素耐藥基因TetB和TetC的多重PCR方法。通過對35株沙門氏菌臨床分離株的四環(huán)素耐藥性的檢測，結(jié)果表明所有沙門氏菌分離株均含TetC基因，與藥敏試驗結(jié)果陽性符合率65.7％(23/35)，其中8株同時含有TetB基因，與藥敏試驗結(jié)果陽性符合率100％，選取其中部分菌株擴增出的TetB和TetC基因片段進行測序分析，結(jié)果表明，所

11、測5株菌的TetB基因擴增產(chǎn)物與質(zhì)粒pRT11中的相應(yīng)序列有很高的同源性，均為99.7％，而相互之間的同源性為100％；所測14株菌的TetC基因擴增產(chǎn)物與質(zhì)粒pBR322中的相應(yīng)序列有很高的同源性，均為100％。證實沙門氏菌耐藥基因普遍存在，且同時含有TetB和TetC基因的菌株表現(xiàn)耐藥。建立多重PCR技術(shù)同時檢測四環(huán)素耐藥基因，簡便快速、省時省財，特別適合于大量樣本的檢測，這對開展沙門氏菌四環(huán)素多種耐藥基因的分子流行病學(xué)監(jiān)測提供了有

12、效的檢測途徑。將建立的多重PCR方法用于檢測臨床分離的奇異變形桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌和綠膿桿菌，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥基因TetC也普遍存在上述細菌中，同時檢出TelB和TetC的概率也很高。說明所建立的方法可作為四環(huán)素耐藥基因檢測的通用方法。 7、對廈門市畜禽產(chǎn)品中分離的沙門氏菌分離株進行了24種藥物敏感試驗和五種抗生素的藥物耐受研究。采用24種常用藥敏試紙開展59株沙門氏菌分離株的耐藥情況分析，為養(yǎng)殖場合理用藥提供參考。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)

13、當(dāng)前沙門氏菌耐藥性越來越強，其中普遍對四環(huán)素、強力霉素、氨芐青霉素、青霉素、紅霉素、利福平、麥迪霉素、新生霉素、痢特靈和氯霉素等耐藥，有些菌株甚至對高效抗生素如鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、先鋒V、頭孢拉定和環(huán)丙沙星出現(xiàn)耐藥。其中能耐受3～10種抗生素的菌株數(shù)為2、5、6、13、11、7、3和2，所占百分比為3.4、8.5、10.2、22.0、18.6、11.9、5.1和3.4，能耐受12、14和15種抗生素的菌株為1、5和4株，占1.7

14、％、8.5％和6.8％。其中從廈門地區(qū)生豬飼養(yǎng)戶分離的4株菌有3株能耐受15種抗生素，1株耐7種。同時還重點開展了51株分離株對鏈霉素、氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素和磺胺等五種抗生素的藥物耐受研究，結(jié)果四環(huán)素耐藥超過16ug／ml的菌株達35株(占68.6％，35/51)，鏈霉素耐藥超過16ug/mI的菌株達23株(45.1％，23/51)、氨芐青霉素超過16ug/ml的菌株達14株(占27.5﹪,14/51)、氯霉素超過16ug/ml的