去乙酰化抑制劑對五指山小型豬體細胞核移植胚胎發(fā)育能力的影響.pdf

1、目前通過體細胞核移植（SCNT）技術(shù)已經(jīng)成功獲得多種哺乳動物的克隆后代，但動物克隆的成功率仍較低，大量的研究表明其可能是SCNT后表觀遺傳重編程的失敗所致。組蛋白的高乙?；梢栽鰪娹D(zhuǎn)錄因子與核小體之間的相互作用，從而有利于基因轉(zhuǎn)錄的啟動。組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi），丙戊酸（VPA）、Scriptaid等能增加基因組中組蛋白的乙?；?。本研究利用VPA、Scriptaid能夠抑制重構(gòu)胚早期組蛋白去乙酸化的作用這一機制，對體細胞

2、核移植后的重構(gòu)胚進行不同濃度及不同時間的處理，觀察并探討其對克隆胚胎體內(nèi)及體外發(fā)育能力的影響。
　　第一章：本研究以五指山小型豬成纖維細胞為供體細胞進行SCNT重構(gòu)胚胎的構(gòu)建，重構(gòu)胚胎激活后培養(yǎng)在添加不同濃度（0～8mM）VPA的胚胎培養(yǎng)液中進行不同時間（0～48h）的體外培養(yǎng)，探討了HDACi-VPA對五指山小型豬SCNT克隆胚胎的體外及體內(nèi)發(fā)育能力方面的影響。實驗1研究不同濃度的VPA在處理核移植胚胎24 h條件下對其克隆胚胎

3、體外發(fā)育力的影響。實驗結(jié)果表明2mM VPA處理組（21.5％）克隆胚胎的囊胚發(fā)育率顯著高于對照組、4mM處理組及8mM處理組（21.5 vs10.5,12.6,17.2，p<0.05）。實驗2選擇實驗1中篩選出的最佳濃度2mM為本實驗的處理濃度，研究此濃度在不同添加處理時間的條件下對化學激活后核移植克隆胚胎的體外發(fā)育能力的影響。實驗結(jié)果表明VPA處理24h組（20.7%）的囊胚發(fā)育率顯著高于其它各組(對照組9.2%,12h處理組12.

4、1%,48h處理組9.1%，p<0.05)。實驗3將1～8細胞期的2mM VPA處理24h克隆胚胎（192～216枚）和未經(jīng)處理(對照組)的克隆胚胎（179～225枚）分別移植到7頭自然發(fā)情的受體母豬中。經(jīng)B超檢測其中VPA處理的3頭受體母豬全部妊娠，2頭足月分娩共產(chǎn)11頭克隆仔豬，對照組的4頭受體母豬3頭妊娠，2頭足月分娩共產(chǎn)12頭克隆仔豬。實驗發(fā)現(xiàn)VPA處理組克隆仔豬初生重及出生后3個月生存率，均低于未處理組克隆仔豬（675.2±1

5、85.3）。綜合以上結(jié)果表明，VPA處理體細胞核移植胚胎可以提高克隆胚胎的體外囊胚率，對于體內(nèi)發(fā)育能力有必要進一步研究。
　　第二章：本研究探討了HDACi-SCR對五指山小型豬SCNT克隆胚胎的體外及體內(nèi)發(fā)育能力方面的影響。實驗1研究不同濃度的SCR在處理核移植胚胎24h條件下對其克隆胚胎體外發(fā)育力的影響。實驗結(jié)果表明處理250nM處理組(20.0%)較對照組（12.2%）、50nM處理組（8.9%）及500nM處理組（11.9

6、%）顯著提高，p<0.05。實驗2研究250nM SCR在不同的處理時間的條件下對化學激活后克隆胚胎的外發(fā)育能力的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCR處理24h組（22.2%）克隆胚胎的囊胚發(fā)育率較12 h處理組（10.0%）顯著提高，p<0.05，與48h處理組（18.5%）沒有差異，p>0.05。實驗3分別以SCR、VPA及SCR+ VPA處理化學激活后的體細胞核移植克隆胚胎，研究并探討了SCR和VPA聯(lián)合處理對克隆胚胎的體外發(fā)育力的影響。結(jié)果

7、表明250nM SCR和2mM VPA聯(lián)合處理24h組與對照組相比克隆胚胎的囊胚率顯著提高（18.3 vs9.2%，p<0.05），但與250nM SCR處理24h組（19.9%）及2mM VPA處理24h組（18.9%）比較囊胚率無顯著性差異（p>0.05）。實驗4研究了SCR對體細胞核移植克隆胚胎的體內(nèi)發(fā)育情況的影響，將250nM SCR處理24h與對照組經(jīng)過體細胞核移植后獲得克隆胚胎分別移植于代孕母后，對照組移植的受體可成功產(chǎn)下健

8、康的克隆仔豬，而SCR處理組并未獲得克隆仔豬。綜合以上結(jié)果表明，SCR處理體細胞核移植胚胎可以提高克隆胚胎的體外囊胚率，對于體內(nèi)發(fā)育能力有必要進一步研究。此外，SCR與VPA聯(lián)合處理對體細胞核移植克隆胚胎的體外發(fā)育無協(xié)同作用。
　　第三章：增強型綠色熒光蛋白(EGFP)在轉(zhuǎn)基因動物的研究中可用來標記目的基因、篩選陽性胚胎、建立熒光動物模型：如將EGFP或紅色熒光蛋白基因插入到豬的基因組內(nèi)，可以很方便的對細胞和組織內(nèi)某些因子的表達和

9、代謝進行跟蹤，從而為基礎(chǔ)性研究提供便利。本試驗以獲得的轉(zhuǎn)EGFP基因陽性細胞作為供體細胞，經(jīng)核移植和電融合后在2mM VPA處理24h的轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚移入去核的卵母細胞中，成功地獲得了轉(zhuǎn)基因囊胚，并比較克隆胚胎體外及體內(nèi)發(fā)育情況。結(jié)果表明GFP轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚重構(gòu)胚體外囊胚率為15.1%，與未轉(zhuǎn)基因組11.4%相比無顯差異著(P>0.05)。將1～8細胞階段重構(gòu)胚胎移植到3頭自然發(fā)情的五指山小型豬輸卵管內(nèi)，2頭未發(fā)育到期而返情，1頭懷孕106

10、天后，成功產(chǎn)下4頭克隆豬。其中2頭為死胎,體重分別為247g和313g，其余2頭在分娩后由于飼養(yǎng)管理不善死亡,體重分別為366g和573g。經(jīng)過對豬皮膚組織外來基因檢測及受體母豬、克隆豬與供體細胞的13個多態(tài)性位點的微衛(wèi)星檢測結(jié)果表明，其中2頭具有綠色熒光遺傳特征，4頭克隆豬個體與供核細胞具有完全相同的多態(tài)性，而克隆豬個體與代孕母豬的多態(tài)性不同，證明克隆仔豬與代孕母豬無親緣關(guān)系。研究結(jié)果為轉(zhuǎn)基因五指山小型豬體細胞克隆的技術(shù)體系建立提供參