PPAR-,γ-、KLF6在大鼠NASH肝纖維化發(fā)生中的作用及羅格列酮干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分：PPARγ、KLF6在大鼠NASH肝纖維化形成過(guò)程中的表達(dá)及意義 目的：觀察核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、KLF6在大鼠NASH肝纖維化形成過(guò)程中的表達(dá)以及與肝星狀細(xì)胞活化、TGFβ1表達(dá)的相關(guān)性，探討其在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)生中的作用。 方法： 1、建立NASH肝纖維化動(dòng)物模型：選用4周齡雄性Wistar大鼠(體重170～210g)60只隨機(jī)分為基礎(chǔ)飼料組(對(duì)照組，C組)、高脂

2、飼料組(模型組，F(xiàn)組)，分別于喂養(yǎng)第8、12、16、24周4個(gè)時(shí)相點(diǎn)，稱重后麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，留取肝組織標(biāo)本，部分制成石蠟切片，行HE和Masson染色；部分-70℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2、動(dòng)態(tài)觀察各組：①體重變化；②HE和Masson染色觀察肝臟組織病理改變；③血清游離脂肪酸(freefattyacid，F(xiàn)FA)、甘油三脂(triglyceride，TG)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotrasferase，ALT)和天

3、門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartateaminotrasferase，AST)的變化；④放射免疫法檢測(cè)血清中透明質(zhì)酸(hyaluronic,HA)、層粘連蛋白(laminin,LN)、CⅣ型膠原(collagentypeⅣ，CⅣ)水平；⑤免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PPARγ、KLF6、α-SMA的陽(yáng)性表達(dá)率。⑥RT-PCR檢測(cè)肝組織PPARγ、KLF6、TGFβ1、α-SMA的mRNA表達(dá)： 結(jié)果： 1、體重情況：各組大鼠體重隨造模

4、時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸增高趨勢(shì)，但同一時(shí)相點(diǎn)比較模型組體重均高于相應(yīng)對(duì)照組(P＜0.05)； 2、HE和Masson染色結(jié)果：C組大鼠肝臟無(wú)異常發(fā)現(xiàn)；F組大鼠肝臟8周時(shí)出現(xiàn)單純性脂肪肝(F2-3)的病理變化，即以小泡性為主的混合性脂肪變性，無(wú)炎癥和纖維化；12周時(shí)除脂肪變性外，尚可見(jiàn)腺泡3帶少數(shù)氣球樣肝細(xì)胞，小葉內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，點(diǎn)灶樣壞死，部分已演進(jìn)為非酒精性脂肪性肝炎，達(dá)NASH-F(2-4)G(0-1)SO診斷標(biāo)準(zhǔn)；16周時(shí)大鼠肝組織

5、小葉內(nèi)炎癥進(jìn)一步加劇，匯管區(qū)亦可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡3帶明顯的氣球樣肝細(xì)胞，部分大鼠肝組織出現(xiàn)竇周/細(xì)胞周纖維化，達(dá)NASH-F(3-4)G(1-3)S(0-1)診斷標(biāo)準(zhǔn)；24周大鼠仍呈中.重度脂肪肝，但部分大鼠炎癥程度較16周時(shí)有所減輕而均出現(xiàn)竇周/細(xì)胞周纖維化，尚可見(jiàn)明顯橋接樣纖維化，達(dá)NASH-F(3-4)G(0-2)S(1-3)診斷標(biāo)準(zhǔn)； 3、血清學(xué)指標(biāo)：F組血清TG、FFA水平8周起明顯增高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0

6、.71±0.08vs0.48±0.04；0.54±0.06vs0.34±0.04，P＜0.05)，并隨高脂飲食的延長(zhǎng)逐漸升高；12周血清AST、ALT亦開(kāi)始升高與對(duì)照組比較有差異(116±7.08vs64.88±8.58；80.23±3.40vs44.35±3.38，P＜0.05)，16周達(dá)到高峰(148.2±8.33、101.6±6.79，P＜0.05)，24周略有下調(diào)(138.4±9.73、90.4±7.68)； 4、血清肝

7、纖維化指標(biāo)的變化：F組12周時(shí)HA含量開(kāi)始增高與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(86.45±11.94vs63.57±9.49，P＜0.05)，并隨高脂飲食的延長(zhǎng)逐漸升高；16周血清LN、CⅣ升高與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(94.15±24.43vs71.93±11.84；59.41±8.89vs27.87±8.4.9，P＜0.05)，24周增高最為明顯，與對(duì)照組比較差異顯著(131.67±59.96VS71.93±11.84:86.31±32.

8、78vs27.87±8.49，P＜0.01)： 5、免疫組織化學(xué)染色：PPARγ在C組肝細(xì)胞胞核中著色淺淡，呈散在分布、弱陽(yáng)性表達(dá)，F(xiàn)組8周時(shí)在脂肪變性明顯的肝細(xì)胞核中表達(dá)開(kāi)始增多，12周幾乎所有脂肪變性肝細(xì)胞核均可見(jiàn)棕黃色表達(dá)，16周隨脂肪性肝纖維化的出現(xiàn)，PPARγ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞較12周開(kāi)始減少，24周PPARγ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少，染色變淺呈淺棕褐色，尤其是肝纖維化形成部位PPARγ陽(yáng)性染色細(xì)胞明顯減少；KLF6在C組肝

9、臟中未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，自12周起在脂肪變的肝細(xì)胞核中可見(jiàn)部分陽(yáng)性表達(dá)，16、24周陽(yáng)性表達(dá)逐漸增多；C組α-SMA僅在血管壁有少量表達(dá)，呈淺棕黃色染色，F(xiàn)組12周時(shí)，除血管壁可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)外，小葉內(nèi)可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，呈散在分布的淺棕褐色染色，16周陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)開(kāi)始逐漸增多，并在纖維束沉積部位著色深，24周陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)最多、染色深，呈棕褐色，陽(yáng)性細(xì)胞多位于匯管區(qū)、肝血竇周圍以及纖維間隔等處； 6、RT-PCR結(jié)果：F組大鼠8周時(shí)

10、肝組織KLF6、TGFβ1、α-SMAmRNA表達(dá)與對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，12-24周KLF6mRNA表達(dá)逐步上調(diào)，與對(duì)照組比較差異顯著(0.62±0.10、1.01±0.08、0.96±0.07vs0.24±0.05，P＜0.05)，16周TGFβ1、α-SMAmRNA表達(dá)開(kāi)始上調(diào)，24周達(dá)到高峰與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.62±0.19、0.91±0.07vs0.36±0.16;0.77±0.12、1.08±0

11、.19vs0.30±0.07，P＜0.05)；而PPARγmRNA于高脂喂養(yǎng)8周即明顯上調(diào)(0.84±0.07vs0.54±0.02，P＜0.05))，12周表達(dá)最為明顯(1.06±0.14)，16周脂肪性肝炎明顯時(shí)表達(dá)開(kāi)始下降(0.73±0.01)，24周下降更為明顯，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.36±0.02vs0.54±0.02，P＜0.05)。Pearson直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：高脂24周NASH肝纖維化時(shí)KLF6mRNA與TGF

12、β1、α-SMAmRNA以及肝纖維化分級(jí)評(píng)分之間呈顯著正相關(guān)(r=0.848、0.859、0.706，P＜0.01)。 結(jié)論： 1、我們構(gòu)建的NASH肝纖維化模型是研究脂肪性肝炎肝纖維化發(fā)病機(jī)制的理想模型之一； 2、高脂飲食能夠誘導(dǎo)肝組織KLF6、TGFβ1、α-SMAmRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，且其高表達(dá)與非酒精性脂肪性肝纖維化形成關(guān)系密切，在單純性脂肪肝向脂肪性肝炎、肝纖維化進(jìn)展的過(guò)程中起重要作用； 3、

13、高脂飲食誘導(dǎo)NASH大鼠肝臟。PPARγmRNA和蛋白表達(dá)先升高后下降，推測(cè)高脂飲食誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷使脂肪變的肝細(xì)胞代償性合成PPARγ增加，抑制增高了的各種促炎、促纖維生成因子如KLF6、TGFβ1等的釋放；而當(dāng)損傷因素持續(xù)存在，損傷與抗損傷動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)后PPARγ合成減弱，而KLF6、TGFβ1等促纖維生成因子則明顯增加，激活HSC導(dǎo)致肝纖維化形成。 第二部分：PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)大鼠NASH肝纖維化形成的影響

14、目的：觀察羅格列酮干預(yù)對(duì)NASH肝纖維化大鼠核轉(zhuǎn)錄因子KLF6信號(hào)通路的影響，探討羅格列酮的抗炎、抗肝纖維化效果及機(jī)制。 方法：12只Wistar雄性大鼠高脂喂養(yǎng)8周后，給予4mg/kg/d羅格列酮干預(yù)(干預(yù)組，T組)，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組(C組)和高脂模型組(F組)，24周末稱重后處死所有大鼠，留取血清及肝臟進(jìn)行血脂、肝功、肝纖維化標(biāo)志物、肝組織病理學(xué)染色以及RT-PCR檢測(cè)肝組織PPARγ、KLF6、TGFβ1、α-SMAmRNA

15、和免疫組化檢測(cè)PPARγ、KLF6和α-SMA的表達(dá)。 結(jié)果： ①HE和Masson染色顯示模型組大鼠24周末均可見(jiàn)典型脂肪性纖維化，治療組炎癥、纖維化程度均明顯減輕和改善，但與對(duì)照組相比其炎癥、纖維化程度仍有差異(P＜0.01)； ②血清學(xué)指標(biāo)顯示羅格列酮干預(yù)16周后可明顯降低高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)的TG、FFA、AST、ALT、HA、LN、CⅣ等的增高，兩組間差異顯著(P＜0.01)； ③RT-PCR顯示2

16、4周后模型組KLF6(0.96±0.08)、TGFβ1(0.91±0.07)和α-SMA(1.07±0.19)的相對(duì)表達(dá)量均明顯上調(diào)，與對(duì)照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)；治療組則顯示增高的上述基因呈不同程度的下調(diào)，兩組間差異顯著(P＜0.01)。 ④免疫組化顯示干預(yù)組KLF6、α-SMA的表達(dá)較模型組明顯減少，PPARγ的表達(dá)則明顯增加，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論： 1、羅格列酮可以