PPARγ激動劑羅格列酮保護腎臟纖維化的實驗研究.pdf

1、第一部分 目的：研究過氧化物酶體增值體激活受體(PPAR)γ激動劑羅格列酮(Rosiglitazone，RGZ)抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細胞(HKC)轉(zhuǎn)分化的作用，探討羅格列酮治療腎臟病的機理。 方法：以HKC細胞為研究對象，采用免疫印跡檢測纖維連接蛋白(FN)表達的水平以評價細胞外基質(zhì)合成的變化，以α-SMA為HKC激活的標(biāo)志物。采用免疫熒光對FN的表達進行定位，以明膠酶譜分析法(gel

2、atinzymography)檢測細胞上清中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)表達量的變化。 結(jié)果：實驗結(jié)果表明TGF-β1具有促進HKC細胞表達α-SMA的作用，并可以促進FN合成，羅格列酮能夠抑制TGF-β1所誘導(dǎo)的HKC細胞α-SMA和FN合成，此作用呈明顯的劑量依賴性，和人工合成PPARγ特異性激動劑GW1929作用相似。并且羅格列酮單獨作用于HKC時，也有降低HKC細胞FN合成的作用。TGF-β1有促進HKC培養(yǎng)上清夜中MMP-

3、2表達的作用，此作用呈明顯的時效依賴性，不能為羅格列酮所阻滯。 結(jié)論：羅格列酮能夠阻止TGF-β1誘導(dǎo)的人近端小管上皮細胞細胞轉(zhuǎn)分化與細胞外基質(zhì)的表達與合成，和人工合成PPARγ特異性激動劑GWl929作用相似。第二部分 目的：通過觀察羅格列酮抑制單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)小鼠病變腎組織纖維化的作用，探討羅格列酮治療腎臟病的作用機制。 方法：采用左側(cè)輸尿管結(jié)扎的方法建立單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)雄性CD-1

4、小鼠動物模型，術(shù)后小鼠隨機分為3組：Sham，UUO，UUO+羅格列酮(7.2mg/kg/d)治療組。實驗設(shè)兩個時間點：3天，6天。以α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)做為上皮細胞轉(zhuǎn)分化的觀察指標(biāo)。以纖維連接蛋白(FN)為間質(zhì)纖維化的指標(biāo)，以蛋白印跡技術(shù)(Western blotting)檢測α-SMA、FN的表達，以免疫熒光及蘇木素-伊紅(HE)染色檢測組織中纖維化指標(biāo)的表達及觀察腎組織病變程度。 結(jié)果：單側(cè)輸尿管結(jié)扎可以使小鼠

5、腎組織產(chǎn)生間質(zhì)纖維化，并且梗阻腎FN和α-SMA的表達增加，呈明顯的時效性，羅格列酮可以減輕UUO小鼠腎臟間質(zhì)病變，降低FN和α-SMA的表達水平，抑制上皮細胞轉(zhuǎn)分化。 結(jié)論：羅格列酮可以改善UUO小鼠腎臟的纖維化，其作用可能與減少間質(zhì)纖維連接蛋白的表達和抑制上皮細胞轉(zhuǎn)分化有關(guān)。第三部分 目的：觀察高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞表達纖維連接蛋白(FN)與整合素聯(lián)接激酶(ILK)的關(guān)系，探討糖尿病腎病小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病

6、機制。 方法：以人腎小管上皮細胞株HKC細胞和鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的CD-1小鼠糖尿病動物模型為研究對象，采用蛋白印跡的方法檢測細胞或腎組織ILK和FN蛋白的表達。通過基因轉(zhuǎn)染的方法，將含無激酶活力的人ILK基因表達質(zhì)粒pcMV-kdILK轉(zhuǎn)染HKc細胞，觀察抑制ILK活力對高糖誘導(dǎo)的HKC合成FN的影響。 結(jié)果：動物實驗結(jié)果表明，STZ注射4周CD-1小鼠血糖水平顯著高于對照組(20.3±2.7 vs 6.1±1.

7、4 mmol/L)，同時，腎組織ILK和FN的表達量亦顯著高于對照組，分析結(jié)果表明二者之間存在明顯的相關(guān)性(P<0.01)。細胞培養(yǎng)研究證實，高糖能夠刺激HKC上調(diào)ILK和FN蛋白的表達，并且呈時間和劑量依賴性。HKC細胞轉(zhuǎn)染pCMV-kdILK質(zhì)粒以抑制ILK的活力，能夠顯著地拮抗高糖刺激HKC表達FN的作用。 結(jié)論：高糖能夠通過上調(diào)ILK蛋白造成腎小管表達并合成FN，抑制ILK能夠拮抗高糖刺激HKC合成FN的作用。說明ILK