白花丹醌對(duì)人肝星狀細(xì)胞作用的分子機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化是指肝細(xì)胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時(shí)，肝臟中膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的增生與降解失去平衡，導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積的病理過程，它是一種可逆性病變。目前認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞激活、增殖并大量生成(extracellular matrix，ECM)的過程是肝纖維化病理機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，肝星狀細(xì)胞(hepatic Stellate cell，HSC)的激活和增殖受多種細(xì)胞因子的調(diào)控。因此，阻斷細(xì)胞因子的促增殖作用，有望成為肝纖維化治療的有效手段。

2、近幾年來中醫(yī)藥抗肝纖維化治療研究取得較大進(jìn)展。前期在國(guó)家自然科學(xué)基金的資助下(N0:30760321)證實(shí)白花丹具有抗肝纖維化作用，白花丹的主要抗肝纖維化藥物活性成分是白花丹醌，白花丹醌具有很強(qiáng)的活血化瘀作用。瘦素(leptin)是新發(fā)現(xiàn)的促肝纖維化的細(xì)胞因子，最近研究顯示，leptin具有誘導(dǎo)HSC活化和增殖作用。
　　目的:本課題將以人HSC為對(duì)象，從細(xì)胞和分子水平深入開展白花丹醌對(duì)外源性leptin刺激后HSC之生物學(xué)特性和

3、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子活化方面的研究，主要從抑制HSC激活、增殖、分泌、凋亡及膠原合成等幾方面集中探究白花丹醌減少（抑制）HSC-LX2分泌膠原蛋白的靶位點(diǎn)和可能的作用分子機(jī)制，為開發(fā)廣西特色民族藥材抗肝纖維化提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.MTT法檢測(cè)白花丹醌對(duì)HSC-LX2和人胚肝細(xì)胞(L-O2)毒性的影響以及l(fā)eptin與HSC-LX2作用的時(shí)間和濃度的選擇。
　　2.ELISA法檢測(cè)HSC-LX2細(xì)胞培養(yǎng)上清

4、液中l(wèi)eptin的分泌;檢測(cè)白花丹醌對(duì)HSC-LX2細(xì)胞培養(yǎng)上清液TGF-β1，α-SMA，TNF-α，PDGF-BB，Ⅰ型膠原表達(dá)的影響。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝星狀細(xì)胞細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡的變化。
　　4.透射電鏡觀察肝星狀細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)。
　　5.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)HSC-LX2凋亡相關(guān)蛋白p53，Bax，Bcl-2的表達(dá)。
　　6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)白花丹醌對(duì)HSC-LX2 TGF-β1等細(xì)胞

5、因子表達(dá)。
　　7.Western blot法檢測(cè)白花丹醌對(duì)HSC-LX2細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p53，Bax，Bcl-2;細(xì)胞因子TGF-β1，α-SMA，TNF-α，PDGF-BB; leptin刺激HSC-LX2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白OB-Rb，JAK2，STAT3，ERK1/2等蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　第一部分白花丹醌對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖和肝毒性作用的研究
　　1.白花丹醌對(duì)HSC-LX2 IC50值平均為

6、5.016μg/ml，對(duì)人正常胚肝細(xì)胞L-O2 IC50值為18.852μg/ml。白花丹醌對(duì)HSC-LX2毒性選擇指數(shù)(SI)為3.76，說明白花丹醌對(duì)HSC-LX2具有一定的選擇性毒性作用。
　　2.給藥12h，24 h后，與空白對(duì)照組比較，白花丹醌低、中劑量組細(xì)胞上清液SOD，MDA，LDH含量均無顯著性差異(P＞0.05)，白花丹醌高劑量組與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），給藥48 h后白花丹醌高劑量組與空白對(duì)

7、照組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白花丹醌對(duì)人肝細(xì)胞L-O2有一定的毒性作用，且藥物濃度越高，作用的時(shí)間越長(zhǎng)，毒性越大?？紤]到白花丹醌的毒性作用，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇白花丹醌2μmol/L，8μmol/L作為實(shí)驗(yàn)濃度。
　　第二部分白花丹醌對(duì)leptin刺激人肝星狀細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響
　　1.HSC自分泌leptin的濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而遞減，24 h達(dá)到最低，48 h又上升到原來水平，

8、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分泌的leptin濃度比較無顯著性差異(P＞0.05)，說明HSC自分泌leptin的量變化仍不明確。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)PI染色法檢測(cè)各周期細(xì)胞的DNA含量，結(jié)果顯示，白花丹醌作用HSC-LX224 h后，HSC-LX2細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞的百分比均明顯增高，而S期+G2/M期細(xì)胞總數(shù)的百分比明顯降低;并且隨著藥物劑量的增加，G0/G1期細(xì)胞的百分比增高，而S期+G2/M期細(xì)胞總數(shù)的百分比降低，呈劑量依賴性。白花丹醌阻

9、斷HSC細(xì)胞由G0/G1期向S期、G2/M期轉(zhuǎn)變，從而抑制細(xì)胞DNA合成，抑制細(xì)胞分裂，使細(xì)胞周期進(jìn)程減緩，阻止其發(fā)生增殖。
　　3.與空白對(duì)照組比較，leptin刺激顯著增加了HSC-LX2細(xì)胞周期蛋白Cyclin DI，Cyclin E的含量，阻斷了抑制蛋白p21的表達(dá);白花丹醌則明顯降低了Cyclin D1，Cyclin E1蛋白水平，增加了p21的蛋白表達(dá)。
　　4.細(xì)胞流式術(shù)結(jié)果顯示，白花丹醌作用HSC-LX224

10、 h，HSC-LX2凋亡率明顯增加，白花丹醌2，8μmol/L組和秋水仙堿組HSC凋亡率分別為(3.07±0.30)％，(5.21±0.41)％，(10.1±1.08)％，均顯著高于空白對(duì)照組(1.40±0.13)％(P＜0.01)。表明白花丹醌對(duì)HSC-LX2有一定的促凋亡和致壞死的作用。
　　5.電鏡結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞膜、核膜完整，細(xì)胞表面有大量微絨毛。白花丹醌組可見少量壞死細(xì)胞和許多不同程度的凋亡細(xì)胞。陽(yáng)

11、性對(duì)照組可見少量壞死細(xì)胞和許多不同程度的凋亡細(xì)胞，其細(xì)胞體積變小，核膜消失，胞質(zhì)濃縮，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，染色質(zhì)邊集，核固縮。
　　6.受leptin刺激后HSC-LX2胞漿內(nèi)表達(dá)少量的bax，Bcl-2，p53，可見少量的棕黃色顆粒，經(jīng)白花丹醌2.8μmol/L干預(yù)后，HSC-LX2促凋亡基因Bax，p53蛋白表達(dá)明顯升高，抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，與leptin對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

12、>　　第三部分白花丹醌對(duì)leptin刺激HSC-LX2分泌細(xì)胞因子的影響
　　1.ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子分泌情況，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，leptin組HSC培養(yǎng)上清液中TGF-β1，α-SMA，TNF-α，PDGF-BB含量顯著增加(P＜0.01)。與leptin組比較，白花丹醌各藥物濃度組上清液中TGF-β1，α-SMA，TNF-α，PDGF-BB的含量明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，且隨著白花丹醌作

13、用濃度增加，對(duì)TGF-β1，α-SMA，TNF-α，PDGF-BB的活性抑制越顯著。
　　2.用2-△△CT方法的公式進(jìn)行計(jì)算，得到相對(duì)于leptin對(duì)照組的TGF-β1，α-SMA，TNF-α，PDGF-BB mRNA相對(duì)表達(dá)量。熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)結(jié)果顯示:空白對(duì)照組HSC有一定量TGF-β1，α-SMA，TNF-α，PDGF-BB mRNA表達(dá)，白花丹醌和秋水仙堿作用24 h后，活化的HSC-LX2內(nèi)TGF-β1，α-SM

14、A，TNF-α，PDGF-BB mRNA含量較leptin對(duì)照組均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.Western blot結(jié)果顯示，leptin與HSC-LX2孵育24 h，可刺激的HSC-LX2 TGF-β1，α-SMA，PDGF-BB蛋白表達(dá)明顯升高，輕微增加TNF-α蛋白的表達(dá)，白花丹醌與HSC-LX2孵育24 h后，明顯減少HSC-LX2 TGF-β1，α-SMA，PDGF-BB蛋白表達(dá)，對(duì)ZNF-α表達(dá)

15、無明顯影響。
　　第四部分從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同水平探討白花丹醌抑制HSC增殖的作用機(jī)制
　　1.以最佳刺激濃度(100 ng/ml)的leptin作用于HSC-LX2，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)OB-Rb的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，leptin(100 ng/ml)可誘導(dǎo)HSC-LX2 OB-Rb的表達(dá)，并呈現(xiàn)一定的時(shí)相變化。leptin刺激HSC-LX26 h后，即見OB-Rb表達(dá)增強(qiáng)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;24h時(shí)達(dá)到高峰(P＜0.01);36 h

16、時(shí)仍保持較高的活化狀態(tài)P＜0.01）;48h后則基本接近初始水平。
　　2.Western blot法研究白花丹醌對(duì)leptin刺激HSC-LX2后蛋白酪氨酸激酶(JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)信號(hào)因子:OB-Rb，JAK2，STAT3，ERK1/2及其磷酸化蛋白、MMP-1，MMP-13的影響。
　　①leptin刺激顯著地增加了OB-Rb受體蛋白的表達(dá)，白花丹醌處理則明顯地降低了OB-Rb

17、受體蛋白的表達(dá)。
　　②與空白對(duì)照組比較，leptin刺激顯著地增加了JAK2，pJAK2蛋白的表達(dá)。與leptin對(duì)照組比較，白花丹醌處理則明顯地降低了pJAK2蛋白的表達(dá)水平(P＜0.01)，但對(duì)JAK2蛋白表達(dá)無明顯影響(P＞0.05)。
　?、叟c空白對(duì)照組相比較，leptin刺激更加顯著地增加了STAT3，pSTAT3受體蛋白表達(dá)水平(P＜0.01)。白花丹醌處理則明顯地降低了STAT3，pSTAT3受體蛋白的表達(dá)(

18、P＜0.05)。
　?、芘c空白對(duì)照組相比較，leptin刺激更加顯著地增加了ERK1/2,pERK1/2蛋白的豐度(P＜0.01或P＜0.05)。白花丹醌處理則明顯地降低了ERK1/2，pERK1/2蛋白的表達(dá)(P＜0.01或P＜0.05)。
　?、菖c空白對(duì)照組比較，leptin刺激可明顯降低HSC-LX2 MMP-1的表達(dá)，MMP-13表達(dá)水平無顯著變化(P＞0.05）。白花丹醌作用HSC-LX224h后MMP-1蛋白表達(dá)

19、水平升高，MMP-13無顯著變化(P＞0.05）。
　?、?與空白對(duì)照組比較，leptin(100 ng/ml)可刺激HSC-LX2 I型膠原的增生和表達(dá)顯著增加，白花丹醌處理組可明顯抑制HSC胞內(nèi)Ⅰ膠原的表達(dá)和分泌。
　　3.ELISA檢測(cè)白花丹醌對(duì)leptin刺激HSC-LX2 I型膠原表達(dá)。結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組比較，leptin對(duì)照組HSC培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原的含量顯著增加(P＜0.01)，與leptin對(duì)照組比較，

20、白花丹醌各藥物濃度組上清液中Ⅰ型膠原的含量明顯降低，差異有顯著性(P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.白花丹醌對(duì)正常人肝細(xì)胞L-O2具有一定的毒性作用，且藥物濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，毒性越大。該藥對(duì)HSC-LX2的毒性作用具有一定的選擇性。
　　2.外源性leptin可促進(jìn)HSC增殖和活化，并呈現(xiàn)劑量、時(shí)間依賴性。
　　3.白花丹醌可通過阻止HSC-LX2由G0/G1期進(jìn)入S期，而抑制leptin所致的細(xì)胞增殖

21、，其作用機(jī)制可能是與其降低cyclin D1，cyclin E1蛋白表達(dá)，提高P21蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　4.白花丹醌對(duì)HSC-LX2有一定的促凋亡和致壞死的作用。白花丹醌誘導(dǎo)HSC凋亡具體機(jī)制在于上調(diào)活化的HSC中p53，bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。
　　5.白花丹醌從基因和蛋白水平抑制外源性leptin刺激HSC-LX2的TGF-β1，α-SMA，PDGF-BB分泌，從基因水平抑制TNF-α的表達(dá)。
　　

22、6.白花丹醌從細(xì)胞膜受體水平抑制外源性leptin刺激HSC的增殖，降低HSC-LX2OB-Rb蛋白的表達(dá)。
　　7.白花丹醌可通過阻斷HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)JAK2-STAT3信號(hào)通路，降低JAK2，STAT3蛋白磷酸化水平，從而抑制外源性leptin刺激的HSC-LX2增殖。
　　8.白花丹醌阻斷l(xiāng)eptin誘導(dǎo)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)因子ERK蛋白磷酸化，在HSC的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上顯著抑制HSC的增殖。