葉酸對(duì)肝星狀細(xì)胞再程序化作用的研究.pdf

1、肝纖維化是肝臟損傷后的病理性修復(fù)反應(yīng)，其特征是肝臟中肝星狀細(xì)胞(hepaticStella cells，HSCs)激活、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過(guò)度沉積，本研究檢測(cè)了葉酸攝取相關(guān)基因在原代HSCs活化過(guò)程中的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Folr1基因的表達(dá)在HSC活化過(guò)程中持續(xù)性增強(qiáng)，而Slc19a1和Slc46a1的表達(dá)則表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，這表明FR-α在HSCs攝取葉酸方面占據(jù)主導(dǎo)作用;葉酸是人體自身不能合成的必需物質(zhì)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、損傷修復(fù)

2、等方面起著重要作用。葉酸缺乏可影響多種細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲以及細(xì)胞表型改變。HSCs的活化是肝纖維化的關(guān)鍵，本研究采用不同濃度葉酸(0mg/L葉酸缺乏組、1 mg/L中濃度組、5mg/L高濃度組)處理HSC-T6細(xì)胞，研究葉酸對(duì)HSC-T6細(xì)胞的作用，探索葉酸能否抑制HSCs活化或者逆轉(zhuǎn)已活化HSCs至靜息態(tài)。
　　首先，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)，觀察到葉酸缺乏可以抑制HSC-T6細(xì)胞的生長(zhǎng);BrdU，AO/PI雙染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)

3、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葉酸缺乏抑制HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)是通過(guò)抑制HSC-T6細(xì)胞增殖和促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示:葉酸缺乏可以抑制HSC-T6細(xì)胞遷移，這表明葉酸參與調(diào)控T6細(xì)胞的表型改變。
　　其次，通過(guò)QPCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏作用下HSC-T6細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的表達(dá)顯著低于中濃度組和高濃度組，而ERK1/2的表達(dá)無(wú)顯著差異，這表明葉酸缺乏可通過(guò)下調(diào)ERK1/2

4、途徑中p-ER1/2的表達(dá)抑制HSC-T6細(xì)胞增殖;葉酸缺乏組中p-p53和p-p21的表達(dá)顯著高于其余兩組，而p53和p21的在不同濃度葉酸作用HSC-T6細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)無(wú)顯著性差異。這表明葉酸缺乏通過(guò)上調(diào)p53信號(hào)通路中p-p53和p-p21的表達(dá)促進(jìn)HSC-T6凋亡;葉酸缺乏組中細(xì)胞代謝相關(guān)基因a-SMA和Vimentin的表達(dá)顯著低于其余兩組，而E-cadherin顯著高于其余兩組，隨后我們研究了細(xì)胞代謝途徑中的關(guān)鍵蛋白PKM2的

5、表達(dá)，發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏組中PKM2表達(dá)同樣顯著低于其余兩組，這表明葉酸缺乏上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)及下調(diào)間葉細(xì)胞標(biāo)志α-SMA、Vimentin和PKM2等蛋白表達(dá)而表現(xiàn)出MET轉(zhuǎn)變。
　　CCN蛋白因子是具信號(hào)傳遞功能的細(xì)胞基質(zhì)蛋白，參與組織修復(fù)反應(yīng)并涉及肝纖維化發(fā)生發(fā)展。本研究在制備了高純度的大鼠原代HSCs并通過(guò)體外培養(yǎng)進(jìn)行激活的基礎(chǔ)上，同步定量分析了6個(gè)CCN因子在激活過(guò)程中的表達(dá)，對(duì)CCN因子在HSCs激