基于DHPLC同源及異源雙鏈分析的β珠蛋白基因已知突變和多態(tài)性位點的快速分型.pdf

1、背景與目的： β地中海貧血(簡稱β地貧)是世界上最常見的常染色體單基因隱性遺傳病之一。β地貧在全球許多地區(qū)具有很高的發(fā)生率，目前公認的原因是由于瘧疾選擇的結果。因此地貧主要分布在瘧疾高發(fā)的熱帶亞熱帶地區(qū)，從地中海沿岸和非洲大部分地區(qū)到中東、印度次大陸、中國南方、東南亞、并延伸至印度尼西亞和太平洋地區(qū)，而美國、中美和南美等國因移民原因也成為高發(fā)地區(qū)。β地貧是我國長江以南各省區(qū)高發(fā)的血液遺傳病，廣東、廣西、海南、江西、臺灣和香港等地

2、尤為突出，受累人口多達2億以上。 β地貧是由于β-珠蛋白基因突變導致β-珠蛋白肽鏈缺如(β°)或合成不足(β<'+>)而引起的遺傳性溶血性貧血病。β地貧的分子病理具有高度的異質性，主要為11號染色體上β-珠蛋白基因點突變、小的缺失或插入。目前全世界已報道的基因突變類型達200多種，不同種族人群有其自身的常見突變類型。重型β地貧是致死性疾病，患者必需通過定期輸血和去鐵治療來維持生命，因此，β地貧仍是這些高發(fā)地區(qū)最關心和最棘手的公共

3、健康問題之一。對于一個地貧高發(fā)的地區(qū)或國家而言，控制該病的最有效途徑是在遺傳流行病學研究的基礎上制訂預防計劃，通過實施大人群的篩查和高風險夫婦的產前診斷來防止重癥患兒的出生。 β地貧的基因診斷和產前診斷先后經歷了DNA點雜交、限制性內切酶酶譜分析、限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)連鎖分析、寡核苷酸探針雜交(Allele Specific Oligo

4、nucleotide，ASO)和基因芯片(Gene Chip)等技術。目前，用于診斷β地貧的分子生物學方法主要為經典的反向點雜交(Reverse Dot Blot，RDB)技術。但上述方法存在操作煩瑣，對引物標記、探針合成及標記技術要求較高，診斷速度慢，不適合進行大人群篩查，容易出現假陽性和假陰性結果并進一步導致誤診或者漏診等缺點。高效液相色譜技術(Denaturing high-performance liquid chromatog

5、raphy，DHPLC)已被證明是一種精確、高效、經濟、高通量自動化的檢測己知點突變及篩查未知突變的方法。其敏感性和特異性可達96％～100％，明顯高于常用的DGGE、CCM、CSGE、SSCP等變異檢測技術，目前只有基于毛細管電泳技術發(fā)展起來的熒光單鏈構像多態(tài)性分析(F-SSCP)在敏感性和特異性方面能與DHPLC相媲美。另外，若同時選多個溫度條件進行分析還能進一步增加DHPLC的變異檢出率。 本研究的目的是基于DHPLC上述

6、特點，建立一種快速、高靈敏度、準確、經濟、高通量自動化的β地貧診斷方法，用于已知β地貧點突變的快速基因診斷和產前診斷以及發(fā)現新的突變位點或單核苷酸多態(tài)性位點(Single NucleotidePolymorphisms，SNPs)。 設計與方法： 針對中國人群β地貧已知35種突變類型及其在β珠蛋白基因中的位置，設計三對涵蓋所有突變熱點區(qū)的特異性聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)引物

7、，通過條件優(yōu)化實現在同一條件下的常規(guī)PCR擴增。PCR產物在DHPLC半變性條件下，對同源雙鏈或異源雙鏈進行分析，不同基因型表現為洗脫峰峰型的差異和/或保留時間長短的差異。795例基因組DNA樣品作為本方法學建立的基礎，其中包括407例經RDB確診的患者基因組DNA樣品和388例正常人基因組DNA樣品。 隨機抽取其中的319例基因組DNA樣品進行測序分析，作為盲法對照實驗，用于評價本方法的準確性。這319例DNA樣品包括258例

8、β地貧點突變或點突變復合多態(tài)性位點的DNA樣品和61例正常DNA樣品。此外，經DHPLC分析獲得的與已知突變峰型不同的樣品，通過DNA測序以期發(fā)現新突變或SNP位點。本方法建立及評價完成后，將其用于β地貧的臨床產前診斷，并與RDB診斷方法的結果進行比對，得出本方法的實用性。 結果與討論： 本研究共檢測分析了795例DNA樣品，這些樣品中包含了20種不同β珠蛋白基因突變類型和8個多態(tài)性位點。通過DHPLC方法檢測分析，得到

9、了68種不同的特異性洗脫峰標準圖譜。在盲法對照實驗中，得到了與DHPLC檢測方法完全一致的分析結果。同時在實驗過程中，還檢測到了4例用常規(guī)分析手段未檢測出的新突變，這4例新突變均為首次報道。此外還發(fā)現一例-98突變，但其是否對β地貧構成貢獻有待進一步研究。應用DHPLC對9例中國家系進行產前診斷的結果與RDB方法診斷結果完全一致。 本研究建立的基于DHPLC的β地貧已知突變基因診斷技術是一種高通量、高靈敏度、自動化、快速、準確、