江豚單核苷酸多態(tài)性位點SNPs篩選及分型方法研究.pdf

1、本論文共包括三個部分：
　　 1）概述了單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）標記及其在生態(tài)、進化和種群生物學中的應用。
　　 2)篩選單核苷酸多態(tài)性位點：通過構建江豚（Neophocaena phocaenoides）的基因組霰彈槍法文庫（whole-genome shotgun library），通過克隆測序獲得了98個序列。根據(jù)這些序列設計了74 對引物，其中69

2、 對能進行成功的PCR 擴增。
　　 通過69 對引物在24個江豚個體中擴增產(chǎn)物的變性高效液相色譜（denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC）分析，發(fā)現(xiàn)其中25 對引物的擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)多態(tài)，并通過測序驗證確定其中24個擴增產(chǎn)物中含有SNPs。通過進一步的篩選，共確定31個SNPs，其中顛換6個，轉換25個，沒有發(fā)現(xiàn)缺失或插入。
　　 DHPLC 分析時的假

3、陽性率大約為4％，構建基因組文庫結合DHPLC的方法可以用于非模式生物SNPs的大規(guī)模篩選。
　　 3）通過Y染色體比較錨定序列示蹤（Y chromosome comparative anchortagged sequences，YCATS）法，選擇人、小鼠及其它哺乳動物中已知的13對YCATS引物，通過PCR反應從江豚基因組中擴增出相應的DNA片段，結合DHPLC和DNA直接測序等技術，進行江豚單核苷酸多態(tài)性位點的篩選，共得到

4、大約4500bp的序列。通過不同個體同源序列的比對分析，發(fā)現(xiàn)其中的4對引物中DNA片段具有多態(tài)性，共檢測出3個SNPs位點和一個插入或缺失，即大約每1500bp出現(xiàn)一個SNP。
　　 利用片段長度差異等位基因特異性PCR（fragment length discrepant allele specificPCR，F(xiàn)LDAS—PCR)結合雙色紅外熒光檢測技術（LI-COR 4300 DNA Analyzer）來對中國水域江豚種群進