基于鎖核酸探針及納米磁載體的基因分型技術(shù)用于耐藥基因多態(tài)性檢測的研究.pdf

1、目的：
　　單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）是指基因組中由單個核苷酸突變而引起的多態(tài)性變化，即基因組內(nèi)某一特定位點的核苷酸存在不同堿基差異的現(xiàn)象，在已知的DNA多態(tài)性中占大約90％，大多數(shù)位點為二等位基因，也存在一些三等位基因。對于SNPs的研究是繼限制性酶切片斷長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、可變串

2、聯(lián)重復(fù)序列(variablenumber of tandem repeat，VNTR)和微衛(wèi)星多態(tài)性（microsatellite polymorphism）的之后的更深層次的基因多態(tài)性研究。自從1994年第一次被提出之后，如今已成為臨床及藥物研發(fā)領(lǐng)域的重要研究對象，成為表觀遺傳學(xué)、重大疾病患病風(fēng)險評估、基因靶向治療、腫瘤多藥耐藥機制等領(lǐng)域的熱門研究方向。
　　化療是臨床治療惡性腫瘤的重要手段之一?；煹某晒εc否關(guān)系著手術(shù)方案的制

3、定及術(shù)后的最終效果。腫瘤細胞多藥耐藥性(multi-drug resistance，MDR)的產(chǎn)生是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一。在對多藥耐藥基因SNPs的研究中，已經(jīng)確認基因ABCB1的兩個位點C3435T和G2677T/A的多態(tài)性與腫瘤細胞多藥耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)，其中C3435T位點的多態(tài)性還與某些腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如乳腺癌、大腸癌等?；駻BCG2編碼的BCRP蛋白是ABC轉(zhuǎn)運體家族的成員之一，以“藥泵”形式減少胞內(nèi)ATP依賴性

4、藥物蓄積，與多藥耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。有研究顯示，ABCG2基因421 C＞A突變與BCRP表達低水平相關(guān)。由此可見，多藥耐藥基因關(guān)鍵SNPs位點的突變能夠顯著影響細胞多藥耐藥性的產(chǎn)生及一些惡性腫瘤的患病風(fēng)險。能夠準確、快速、高通量的檢測多藥耐藥基因關(guān)鍵SNPs位點的基因型，對于個體化治療方案、腫瘤等多種疾病的患病風(fēng)險預(yù)測及對SNPs進行更深入的研究均具有重要作用。
　　目前SNPs分型技術(shù)眾多，主要有限制性內(nèi)切酶酶切法（PCR-

5、RFLP法）、SNPshot、質(zhì)譜、PCR引物錯配、Taqman探針法、分子信標法、高分辨率熔解曲線法(HRM)，焦磷酸測序(Pyrosequencing)、InvaderrM、SNPlexl和基因芯片等方法。其中PCR-RFLP法和Taqman探針法產(chǎn)作為經(jīng)典技術(shù)常被用于實驗室條件下的基礎(chǔ)研究，焦磷酸測序技術(shù)被視為目前基因測序的“金標準”，基因芯技術(shù)近幾年得到了高速發(fā)展，其最大特點是具有高通量的特性，一次實驗可同時檢測幾十萬個SNPs

6、位點，是大規(guī)模關(guān)聯(lián)分析最主要的手段。這些SNPs分析技術(shù)在不同的條件下發(fā)揮著各自的優(yōu)勢，但也存在著一些不足，比如操作復(fù)雜、檢測時間長、高成本及嚴重依賴大型檢測設(shè)備等弊端都限制了這些技術(shù)的廣泛應(yīng)用。近年來，隨著新型非天然核苷酸的不斷出現(xiàn)及納米技術(shù)的迅猛發(fā)展及，SNPs基因分型技術(shù)也不斷改良。
　　鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)作為一種特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物，其戊糖環(huán)的2'-O和4'-C間形成一個甲基橋結(jié)構(gòu)

7、，這一結(jié)構(gòu)降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，形成了剛性的縮合結(jié)構(gòu)。這種雙環(huán)結(jié)構(gòu)使LNA與互補序列雜交時具有更高的熱穩(wěn)定性，攜帶一個LNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)比普通的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)Tm值高出7-9℃;而與單堿基錯配的序列雜交時形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)也比普通的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)更不穩(wěn)定。因此，LNA修飾的寡核苷酸探針比DNA寡核苷酸具有更高的特異性，使其在基因表達檢測及SNP分型技術(shù)中有著良好的應(yīng)用研究前景。
　　磁性微粒(

8、Magneticparticles)，又稱磁珠，構(gòu)成元素包括磁性金屬如Fe、Co、Ni或其金屬氧化物等，這些磁性金屬或其金屬氧化物的納米級粒子與高分子或無機材料等形成的一種膠態(tài)液體復(fù)合物，統(tǒng)稱為納米磁微粒。其中Fe3O4的納米粒子理化性質(zhì)穩(wěn)定，制備方法成熟，除了具有普通納米微粒的理化屬性外，還具有超順磁性強的優(yōu)點。通過對其表面進行功能化修飾，F(xiàn)e3O4的納米粒子作為目標物載體可在外加磁場的作用下快速移動和分離，已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域新的研

9、究手段用于核苷酸片段、靶蛋白及靶細胞的高特異性分離、純化及篩選。
　　基于本領(lǐng)域已有的研究基礎(chǔ)，本研究設(shè)計開發(fā)了三種新的SNPs檢測方法。分別是基于納米磁載體的酶聯(lián)反應(yīng)用于檢測基因ABCB1 G2677T/A的單核苷酸多態(tài)性;基于鎖核酸探針及鹽誘導(dǎo)效應(yīng)的雜交體系用于室溫下檢測ABCB1C3435T單核苷酸多態(tài)性;基于鎖核酸修飾的分子信標二聯(lián)體用于室溫下檢測ABCG2 C421A單核苷酸多態(tài)性。主要用于室溫下準確、快速、高通量檢測多

10、藥耐藥基因SNPs關(guān)鍵位點。
　　方法：
　　1.本研究采用碘化鉀法從抗凝血漿樣本中提取全基因組DNA。樣本來自2008年1月～2012年7月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院進行住院治療及同期在同一醫(yī)院體檢中心進行健康體檢且體檢結(jié)果正常、無腫瘤病史及遺傳病史且年齡、性別分別與病例組相匹配的健康志愿者人群。
　　2.引物設(shè)計與合成均根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov

11、/snp/)中提供的基因序列，采用PubMed在線軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools)及Oligo6.0軟件設(shè)計PCR擴增引物和探針序列。利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫中的引物BLAST工具（http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列對比，確定引物的準確度及特異性。根據(jù)基因的目標序列和所選擇的多態(tài)性位點，設(shè)計引物序列及目的條帶長度。
　　3.本研究

12、第一部分采用EDC/NHS法對羥基-納米磁顆粒進行表面活化，再與5′端修飾氨基的寡核苷酸偶聯(lián);第二部分和第三部分采用EDC一步法活化法偶聯(lián)鏈霉親和素(SA)，再與5'端修飾生物素的寡核苷酸偶聯(lián)。最后均分散于含有0.05％ NaN3和1％ BSA的pH7.4的PBS中，4℃保存。
　　結(jié)果：
　　1.基于納米磁載體的酶聯(lián)反應(yīng)用于檢測基因ABCB1 G2677T/A的單核苷酸多態(tài)性。
　　(1)納米磁珠與捕獲探針偶聯(lián)效率:

13、根據(jù)公式計算出納米磁珠與捕獲探針的偶聯(lián)效率為95.87％;
　　(2) ABCB1 G2677 T/A有三種SNP亞型，信號探針分別與3種模板進行酶聯(lián)反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察到3條信號探針均只在完全互補模板存在時檢出熒光，與單堿基錯配模板的雜交后未檢出熒光。
　　(3)瓊脂糖電泳結(jié)果顯示在150-200 bp之間有唯一PCR產(chǎn)物條帶，無雜帶出現(xiàn)，是173 bp的目的DNA。
　　2.基于鎖核酸探針及鹽誘導(dǎo)效應(yīng)的雜交體系

14、在室溫下檢測ABCB1 C3435T單核苷酸多態(tài)性。
　　(1)發(fā)現(xiàn)不同鈉離子Buffer中LNA-probe與不同模板的HRM曲線不同，總體呈現(xiàn)兩種形狀。一種是正常的“S”型HRM曲線，LNA-probe在低鈉離子濃度Buffer中與兩種模板生成的曲線均為這種形態(tài)，而當(dāng)鈉離子濃度介于兩者之間時，在同一Buffer中LNA-probe與兩種模板的HRM曲線發(fā)生了顯著的“分離”傾向:SM模板與探針生成的曲線形態(tài)接近前者，互補模板與探

15、針生成的曲線形態(tài)接近后者，序列相同的DNA-probe與兩種模板在任一鈉離子濃度Buffer中均未顯示出HRM曲線“分離”的傾向，[Na+]為0.25 M和0.5 M的條件下均有此現(xiàn)象發(fā)生;
　　(2)加入甲酰胺后，探針與模板的HRM曲線向低溫方向發(fā)生平移，平移距離與甲酰胺用量成正比;
　　(3)溫度波動對探針準確度影響的考察結(jié)果為在20℃、25℃、30℃溫度下探針準確率為100％;在15℃下，探針的準確率為80％，出現(xiàn)了一

16、次假陽性;在35℃下，探針的準確率為60％，出現(xiàn)了2次假陰性;
　　結(jié)論：
　　1.方法一可以用于檢測基因ABCB1 G2677T/A的單核苷酸多態(tài)性;
　　2.納米磁微粒具有物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，粒徑小易分散，比表面積大，超順磁性等特點，寡核苷酸探針與其偶聯(lián)后，可大幅提高固液兩相界面的DNA雜交速率，并能夠快速純化目的產(chǎn)物，非常適合作為載體用于體外診斷試劑的研發(fā);
　　3.T4 DNA連接酶催化的鏈連接專一快速，

17、適用于催化溫度在15-25℃之間的DNA雜交反應(yīng);
　　4.方法二可以在室溫下快速檢測基因ABCB1 C3435T的SNP。
　　5.LNA能夠提高Tm值，LNA探針比普通DNA探針特異性更強。
　　6.基于低鹽誘導(dǎo)效應(yīng)的雜交體系，具有選擇性誘導(dǎo)LNA-DNA雜交的能力，增強探針對單堿基錯配的識別能力;
　　7.方法三可以用于室溫下檢測基因ABCG2 C421A的單核苷酸多態(tài)性;
　　8.首創(chuàng)“啞鈴型”分子