鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）與隱睪發(fā)病的相關(guān)性及分子機(jī)制研究.pdf

1、全文分為二部分 第一部分DEHP與小鼠隱肇發(fā)生的相關(guān)性研究 目的：探討鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEI-IP)與小鼠隱睪發(fā)生的相關(guān)性及其對小鼠睪丸組織學(xué)的影響。 方法：健康KM孕鼠隨機(jī)分成5組：正常對照組、玉米油對照組(玉米油2ml/kg.d)、DEHP低劑量組(DEHP100mg/kg.d)、DEHP中劑量組(DEHP200mg/kg.d)、DEHP高劑量組(DEHP500mg/kg.d)。各組分別于孕鼠妊

2、娠第12d至產(chǎn)后3d(GD12～PND3)(雄性胎鼠睪丸下降的關(guān)鍵時期)持續(xù)經(jīng)口灌注給藥。GD19處死孕鼠，剖宮產(chǎn)取出胎鼠，記錄每只孕鼠胎鼠數(shù)、雄性胎鼠比例、胎鼠體重等情況，同時在解剖顯微鏡下觀察雄性胎鼠睪丸位置、睪丸引帶發(fā)育狀況、顱側(cè)懸韌帶殘留情況、測量睪丸至膀胱頸的相對距離，觀察各組胎鼠睪丸形態(tài)學(xué)變化及PND30時的仔鼠隱睪發(fā)生率。 結(jié)果：(1)DEHP對孕鼠胎鼠數(shù)未產(chǎn)生明顯作用，但對胎鼠體重有一定影響；(2)不同劑量DEH

3、P對胎鼠性腺分化未產(chǎn)生嚴(yán)重干擾；雄性仔鼠比例與對照組沒有顯著差異。(3)正常胎鼠睪丸位于腎臟下極與膀胱頸之間，大多數(shù)睪丸位置靠近膀胱頸，顱側(cè)懸韌帶完全退化；(4)HE染色，光鏡下觀察見DEHP組睪丸生精小管、支持細(xì)胞存在明顯的發(fā)育障礙，DEHP高劑量組睪丸Leydig細(xì)胞明顯增生；(5)小鼠隱睪發(fā)生率與DEHP的劑量有一定的相關(guān)性，DEHP高劑量組隱睪發(fā)生率明顯高于其他組。 結(jié)論： (1)DEHP是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾因子

4、，能誘發(fā)小鼠隱睪；對胎鼠性別分化無明顯影響。 (2)DEHP影響睪丸發(fā)育及干擾睪丸下降，并造成睪丸支持細(xì)胞、睪丸Leydig細(xì)胞和生精細(xì)胞發(fā)育障礙和功能變化； 第二部分 DEHP誘發(fā)小鼠隱翠的分子機(jī)制研究 目的：探討鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)誘發(fā)小鼠隱睪的分子機(jī)制。 方法：選擇胎齡16d的胎鼠睪丸，0.03％膠原酶I消化，3B-HSD染色鑒定及純度測定，錐蟲藍(lán)染色檢測細(xì)胞活率。放免法測定睪丸

5、Leydig細(xì)胞不同培養(yǎng)時間及密度下分泌睪酮的水平。體外實(shí)驗(yàn)中，DEHP染毒劑量分為25、50、100、200mg/L，通過檢測睪酮合成關(guān)鍵酶3p-HSD活性、放免法測定培養(yǎng)液中睪酮濃度，研究DEHP對睪丸Leydig細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)、功能的影響，用MTT法和Annexin-V/PI流式細(xì)胞術(shù)分別檢測DEHP對睪丸Leydig細(xì)胞活力的影響及毒性作用以及凋亡誘導(dǎo)作用，應(yīng)用RT-PCR和原位分子雜交技術(shù)檢測DEHP對睪丸Leydig細(xì)胞

6、INSL3mRNA表達(dá)的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：DEHP分別以低、中、高三組劑量[100、200、500mg/(Kg.d)]灌胃作用于懷孕12d到產(chǎn)后3d(GDl2～PND3)的KM母鼠，觀察DEHP對新生雄性仔鼠體重、睪丸重量、睪丸Leydig細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和3p-羥基類固醇脫氫酶(3p-HSD)活性、酶反應(yīng)面積的影響，RT-PCR檢測新生小鼠睪丸INSL3mRNA表達(dá)的相對強(qiáng)度變化。 結(jié)果： 1．睪丸Leydig細(xì)胞培養(yǎng)前后純

7、度分別為(45.10±1.66)％和(81.17±2.32)％；培養(yǎng)液中可檢測到睪酮，睪酮水平與睪丸Leydig細(xì)胞數(shù)、培養(yǎng)時間相關(guān)，單個睪丸Leydig細(xì)胞睪酮分泌能力逐日下降。2．DEHP(25mg/L)處理12h，或DEHP(50mg/L)處理6h后，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較3p-HSD酶活性明顯降低(P＜0.05)，隨著時間延長和藥物濃度增加差異更顯著(P＜0.01)。DEHP50mg/L、100mg/L實(shí)驗(yàn)組，在12、24h的睪酮水

8、平明顯低于對照組(P＜0.05或P＜0.01)，存在時間－效應(yīng)關(guān)系；DEHP200mg/L實(shí)驗(yàn)組在6、12、24h與對照組比較均有非常顯著差異(P＜0.01)。DEHP200mg/L實(shí)驗(yàn)組可觀察到睪丸Leydig細(xì)胞明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 3．睪丸Leydig細(xì)胞活力隨著DEHP濃度增加和作用時間延長而明顯下降；Annexin-V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測提示死亡細(xì)胞比例隨DEHP濃度升高和作用時間延長而顯著增加，同時細(xì)胞增殖速度變慢

9、，甚至增殖停止，伴隨一系列細(xì)胞形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變，呈劑量、時間依賴關(guān)系。 4．各DEHP處理組透射電鏡可見凋亡典型的形態(tài)學(xué)變化，凋亡指數(shù)及凋亡細(xì)胞比例與對照組比較有顯著或非常顯著差異。(P＜0.05或P＜0.011)。 5．DEHP作用于母鼠后，其雄性子代幼鼠體重和睪丸重量減輕，睪丸Leydig細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；高劑量組睪丸Leydig細(xì)胞數(shù)量明顯增多；低、中劑量組睪酮合成關(guān)鍵酶3p．HSD酶活性下降，酶反應(yīng)

10、面積減小，但高劑量組在PNDl5d時酶活性降低(P＜0.01)，而酶反應(yīng)面積增大(P＜O.01)。 6．DEHP改變原代培養(yǎng)的小鼠胚胎睪丸Leydig細(xì)胞和新生小鼠睪丸的組織、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)；各實(shí)驗(yàn)組包括原代睪丸Leydig細(xì)胞及不同時間點(diǎn)的新生鼠睪丸INSL3mRNA表達(dá)水平、表達(dá)相對強(qiáng)度均明顯低于對照組(P＜0.01，或P＜0.01)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)所用方法分離的胚胎睪丸Leydig細(xì)胞純度較高，生長性好，保持增殖和分