去分化脂肪細(xì)胞生物學(xué)特性及構(gòu)建工程化脂肪組織的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景: 游離脂肪組織移植是臨床上具有廣泛用途的一種方法，但因移植后的脂肪組織吸收率高、造成供區(qū)繼發(fā)畸形等缺點(diǎn)而受到限制。組織工程技術(shù)的發(fā)展為脂肪組織移植指明了前景。目前已證實(shí)脂肪組織來源的干細(xì)胞（ASCs）具有體內(nèi)外多向分化潛能，但目前所能獲得的ASCs是位于人脂肪組織內(nèi)的一個(gè)混雜細(xì)胞群體，只有大約40%的細(xì)胞能向脂肪細(xì)胞分化。因此，ASCs并不能完全滿足脂肪組織工程的發(fā)展需要，尋找一種增殖能力強(qiáng)、成脂分化率高、易于分離的更理想

2、的種子細(xì)胞仍然是研究熱點(diǎn)。脂肪組織內(nèi)除了含有上述的干細(xì)胞外，其主要成分是成熟脂肪細(xì)胞，脂肪細(xì)胞因大量的脂質(zhì)聚集而具有漂浮性，難以體外培養(yǎng)。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為脂肪細(xì)胞是處于分化終末階段，缺乏增殖能力的一種細(xì)胞。然而，國外有研究表明，成熟脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過程中，能發(fā)生脂質(zhì)分解變化，重新啟動(dòng)增殖機(jī)制并分裂增殖。這種生理轉(zhuǎn)變被稱為脂肪細(xì)胞去分化，由去分化得到的細(xì)胞被稱為去分化脂肪細(xì)胞（DA）。廖云君等的研究證實(shí)DA在體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)下具有向成脂、

3、成骨、成軟骨分化等多向分化能力，且較之ASCs有更高的成脂能力。因此，DA有可能成為脂肪組織工程更具前景的種子細(xì)胞來源。然而，目前國內(nèi)外對如何高效提純成熟脂肪細(xì)胞并獲取DA、DA的多向分化潛能的研究還很少，尚未見應(yīng)用DA作為種子細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行組織工程化脂肪組織的構(gòu)建。本研究將針對上述問題進(jìn)行探討。 目的： 1．通過從人脂肪抽吸物的脂質(zhì)部分分離、提純成熟脂肪細(xì)胞，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，研究脂肪細(xì)胞去分化現(xiàn)象，探討脂肪細(xì)胞去分化的

4、原理和方法。 2．通過對DA的形態(tài)觀察和定向誘導(dǎo)，探討DA的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和多向分化潛能。 3．通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將DA與FG可注射性支架混合后注射于裸鼠皮下試構(gòu)建組織工程化脂肪，探討DA作為脂肪組織工程種子細(xì)胞的可行性和潛力。 方法： 從成人吸脂術(shù)后的抽吸物提取成熟脂肪細(xì)胞及ASCs，天花板貼壁培養(yǎng)法使成熟脂肪細(xì)胞去分化，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并獲得DA。油紅“O”染色、阿爾辛藍(lán)染色、茜素紅染色分別鑒定DA成脂分化

5、、成軟骨、成骨分化分化結(jié)果；光鏡及掃描電鏡檢測DA及ASCs與FG支架的相容性；將DiⅠ熒光染料標(biāo)記過的DA-FG混合物（A組，n=8，細(xì)胞量4×10s）和ASCs-FG混合物（B組，n=8，細(xì)胞量4×106）以及空白FG支架（C組，n=8）注射于裸鼠皮下。8周后將新生組織取出，給予大體觀察和濕重測定，HE染色、H染色和油紅“O”染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察、纖維化比率定量測定和熒光顯微鏡觀察以鑒定新生物的性質(zhì)、來源。 結(jié)果：

6、人成熟脂肪細(xì)胞在天花板貼壁法培養(yǎng)下能去分化為成纖維細(xì)胞狀細(xì)胞，經(jīng)過多向分化誘導(dǎo)檢測證實(shí)該細(xì)胞為DA。成脂分化兩周，油紅“O”染色可見DA內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴；成軟骨分化兩周，阿爾辛藍(lán)染色可見DA內(nèi)軟骨基質(zhì)沉積：成骨分化三周，茜素紅染色可見DA內(nèi)出現(xiàn)紅色鈣鹽沉積。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中A組和B組8周后在裸鼠背部皮下均有新生組織塊形成，濕重的x±S分別為0．1249±0．0190（g）和0．0971±0．0166（g）（F=12．350，P=0．01）。纖維

7、化比率的x±S分別為14．20%±2．625%和25．89%±5．314%（F=34．678，P=0．001）。C組未見新生組織形成，支架被完全吸收。新生組織經(jīng)檢測后證實(shí)其為成熟脂肪塊并來源于植入的種子細(xì)胞。 結(jié)論： 1．從成人脂肪抽吸物脂質(zhì)部分中可以分離、提純得到大量的成熟脂肪細(xì)胞。 2．成熟的脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可去分化為DA，DA呈成纖維細(xì)胞狀，增殖活性強(qiáng)，并具有多向分化能力。 3．DA與FG支