人細(xì)胞外基質(zhì)支架聯(lián)合bFGF-PLA納米微球緩釋系統(tǒng)對(duì)人脂肪來源干細(xì)胞構(gòu)建工程化脂肪組織的影響研究.pdf

1、研究背景:
　　 目前，脂肪組織工程技術(shù)理論的發(fā)展，為真正實(shí)現(xiàn)無損傷修復(fù)軟組織缺損和真正意義上的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能重建開辟了新的途徑。但仍有很多因素制約著脂肪組織工程技術(shù)的發(fā)展。其中沒有合適的細(xì)胞支架材料及生物學(xué)活性的細(xì)胞因子是制約其發(fā)展的重要因素。
　　 合適的生物支架材料是組織工程學(xué)中一個(gè)非常重要的組成部分，它不僅是細(xì)胞和生物活性因子進(jìn)入機(jī)體的載體，而且還可以支持細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和分化及分泌活性細(xì)胞因子。理想的脂肪組織

2、工程支架應(yīng)具有:①適于細(xì)胞粘附、增殖和分化的三維空間結(jié)構(gòu);②具有良好的機(jī)械力學(xué)性能，不僅與宿主軟組織特性相匹配，還要能夠抵抗軟組織的壓力支持種子細(xì)胞的生長發(fā)育;③具備良好組成成分，對(duì)組織無毒、無副作用、無免疫原性;④具有特殊的生物刺激作用，如促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)血管生成，促進(jìn)宿主干細(xì)胞的遷移和分化等。但是，雖然目前對(duì)于支架材料的應(yīng)用研究很多，但每種支架材料都有自身的局限性，所以至今仍無適合于脂肪組織工程的理想支架材料。關(guān)于脂肪組織工

3、程支架材料的選用還在不斷摸索當(dāng)中。細(xì)胞外基質(zhì)（ExtracellularMatrix，ECM）是存在于細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子，主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖。ECM中含有大量的細(xì)胞活性成分，從而對(duì)細(xì)胞的粘附、增殖、遷移、分化和基因表達(dá)的調(diào)控發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。脂肪組織當(dāng)中不僅含有大量的細(xì)胞成分，而且還含有豐富的ECM成分，包括膠原、網(wǎng)狀纖維、彈性纖維、神經(jīng)纖維、血管基質(zhì)和淋巴結(jié)。從脂肪組織當(dāng)中提取細(xì)胞外基質(zhì)并構(gòu)建成支架理論上完全具

4、有可行性，國內(nèi)還未見相關(guān)報(bào)道。
　　 堿性成纖維細(xì)胞生長因子（Basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）因具有明顯促進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞(Adipose-derivedstemcells，ADSCs)和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的血管化、遷移和成脂分化的作用，在脂肪組織工程研究領(lǐng)域是一種比較理想的細(xì)胞因子。但是，bFGF在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)擴(kuò)散快、對(duì)熱和酸非常敏感、易被蛋白酶分解、半衰期僅為3～5min，嚴(yán)重限制了其生物學(xué)效應(yīng)的

5、發(fā)揮。藥劑學(xué)的緩釋技術(shù)很好的解決這一難題，它通過微球包埋技術(shù)將bFGF包埋于聚乳酸納米微球中，從而使這種細(xì)胞因子能夠緩慢的釋放，達(dá)到對(duì)周圍環(huán)境持續(xù)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的目的。這種緩釋技術(shù)在脂肪組織工程的研究領(lǐng)域具有很大的研究價(jià)值。
　　 研究目的:
　　 1.從人脂肪組織當(dāng)中分離提取ADSCs，并進(jìn)行多向誘導(dǎo)分化，探討其干細(xì)胞特性及作為脂肪組織工程理想種子細(xì)胞的優(yōu)勢(shì);
　　 2.體外構(gòu)建bFGF聚乳酸納米微球緩釋系統(tǒng)(

6、bFGF-PLA-NS)，檢測(cè)體外緩釋能力;并檢測(cè)這種緩釋微球體外對(duì)ADSCs增殖和成脂分化能力的影響，探討其應(yīng)用于脂肪組織工程研究的可行性;
　　 3.體外收集人脂肪組織，并分離提取細(xì)胞外基質(zhì)，將其制備成粉末狀，分析其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，探討其作為脂肪組織工程支架材料的可行性;
　　 4.體外DiI熒光標(biāo)記ADSCs并將ADSCs與細(xì)胞外基質(zhì)支架進(jìn)行粘附，分析ADSCs與細(xì)胞外基質(zhì)支架的生物相容性，探究這種細(xì)胞外基質(zhì)支架材料能否

7、應(yīng)用于體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn);
　　 5.通過設(shè)計(jì)合理對(duì)照，將細(xì)胞外基質(zhì)支架聯(lián)合bFGF-PLA緩釋微球及ADSCs移植于裸鼠體內(nèi)，探討細(xì)胞外基質(zhì)支架聯(lián)合bFGF-PLA緩釋微球?qū)DSCs構(gòu)建工程化脂肪組織的影響。
　　 材料與方法:
　　 1.ADSCs的體外分離培養(yǎng)及多向誘導(dǎo)分化鑒定
　　 收集抽脂術(shù)患者的脂肪組織，純化后用I型膠原酶消化、過濾、離心、鋪皿進(jìn)行原代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。第3代的ADSCs用于

8、實(shí)驗(yàn)研究。用MTT法繪制細(xì)胞增殖生長曲線;用相應(yīng)的定向誘導(dǎo)液對(duì)ADSCs向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化，并用油紅O、茜素紅和阿新藍(lán)染色進(jìn)行鑒定。
　　 2.體外構(gòu)建bFGF-PLA緩釋微球并檢測(cè)其對(duì)ADSCs增殖和成脂分化能力影響
　　 體外用超聲乳化法構(gòu)建bFGF-PLA緩釋微球，檢測(cè)微球載藥量和包封率;透射電鏡觀察微球包被情況并測(cè)量直徑;用ELISA試劑盒檢測(cè)bFGF-PLA緩釋能力，連續(xù)檢測(cè)21d;體外將

9、不同濃度的bFGF-PLA緩釋微球加入ADSCs培養(yǎng)液及成脂誘導(dǎo)液中，用MTT法和油紅O定量檢測(cè)法檢測(cè)其對(duì)ADSCs增殖和成脂分化的影響，分析緩釋微球最佳的作用濃度，為下一步實(shí)驗(yàn)提供依據(jù);
　　 3.體外構(gòu)建人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架
　　 收集接受抽脂術(shù)患者的脂肪組織，經(jīng)過純化、勻漿、離心、洗滌等處理分離提取人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)并經(jīng)、凍干、粉碎處理將其制備成粉末狀。大體觀察及掃描電鏡觀察其結(jié)構(gòu)特性，分析其作為脂肪組織支架

10、材料的可行性;
　　 4.人ADSCs與細(xì)胞外基質(zhì)支架體外生物相容性的研究
　　 體外將ADSCs用EGFP或者DiI熒光標(biāo)記，檢測(cè)標(biāo)記后細(xì)胞的增殖和成脂分化能力;將標(biāo)記的ADSCs與細(xì)胞外基質(zhì)支架粘附，檢測(cè)粘附率并熒光顯微鏡及掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架表面粘附生長情況，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞與支架粘附后生長增殖情況，并繪制生長曲線，與正常的ADSCs生長曲線相比較;
　　 5.人細(xì)胞外基質(zhì)支架聯(lián)合bFGF-PLA緩釋微

11、球?qū)DSCs體內(nèi)構(gòu)建脂肪組織的影響研究
　　 將ADSCs與人細(xì)胞外基質(zhì)支架及bFGF-PLA形成復(fù)合物，進(jìn)行體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn);分為三組:1組為人細(xì)胞外基質(zhì)支架+細(xì)胞培養(yǎng)液，共0.5ml;2組為人細(xì)胞外基質(zhì)支架+ADSCs混懸液，共0.5ml，含有1×107細(xì)胞量;3組為人細(xì)胞外基質(zhì)支架+ADSCs+bFGF-PLA混懸液，共0.5ml，含有1×107細(xì)胞量和4mg/ml的bFGF-PLA。將以上三組混合物分別注射移植于裸鼠背部皮

12、下，每只移植三個(gè)點(diǎn)。8w后取出新生物，進(jìn)行新生物大體觀察和濕重測(cè)量后，分別行冰凍切片熒光顯微鏡觀察、冰凍切片行油紅O染色定性檢測(cè)及常規(guī)HE染色進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè);高倍鏡下計(jì)數(shù)三組新生血管密度并行統(tǒng)計(jì)分析比較。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理（二級(jí)標(biāo)題）
　　 所得數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.從抽脂術(shù)患者得到的脂肪組織

13、當(dāng)中成功分離得到ADSCs，貼壁生長的ADSCs形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞，具有很強(qiáng)的分裂增殖能力。用成脂、成骨、成軟骨定向分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)2～3周后，分別用油紅O、茜素紅、阿新藍(lán)染色呈陽性反應(yīng)。
　　 2.體外成功構(gòu)建bFGF-PLA緩釋微球，微球表面光滑、球體大小均勻、形態(tài)飽滿;微球直徑平均為（28.98±0.50）nm;微球樣品包封率為(89.54±1.45)％，計(jì)算樣品的載藥量為:{(17.91±0.29)×10-3}％;通過E

14、LISA方法檢測(cè)微球緩釋特性，21d內(nèi)微球可緩慢釋放bFGF，第21d累計(jì)釋藥率為79.85％;bFGF-PLA緩釋微球能夠明顯促進(jìn)ADSCs的增殖和成脂分化的效率，最佳的作用濃度為4mg/ml。
　　 3.人脂肪組織當(dāng)中提取出來的細(xì)胞外基質(zhì)，經(jīng)過凍干粉碎之后外觀呈白色粉末狀，顆粒體積均勻、疏松，其多孔狀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有利于種子細(xì)胞與支架粘附和增殖分化。掃描電鏡觀察可見顆粒表面有較平坦的表面結(jié)構(gòu)，表面積較大，這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)適于細(xì)胞粘附

15、伸展生長。
　　 4.ADSCs經(jīng)Ad.EGFP或DiI熒光標(biāo)記后，其增殖和成脂分化的能力并不會(huì)受到明顯影響;DiI標(biāo)記前后ADSCs與ECM支架的粘附率分別為:(88.81±4.81)％和(86.48±4.58)％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較并無差異性;ADSCs與ECM支架粘附后其增殖能力不會(huì)受到影響。細(xì)胞粘附于支架表面后掃描電鏡觀察可見細(xì)胞呈扁平短梭形或三角形，在支架表面粘附生長狀態(tài)良好。
　　 5.體內(nèi)移植8w后6只裸鼠全部成

16、活，三組均可形成瘤塊，大體觀察第1組、2組和3組體積呈遞增趨勢(shì)，第1組顏色蒼白，第2組顏色淡黃，第3組黃色更接近正常脂肪組織的顏色，三組濕重平均分別為:(0.032±0.005)g;(0.041±0.006)g;(0.049±0.005)g，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理后，三組兩兩之間比較P值均小于0.05，2組較1組為重，第3組較前兩組重;組織切片HE切片可見第3組形成了大量的成熟脂肪細(xì)胞，細(xì)胞聚集成巢狀，第2組也可形成成熟的脂肪細(xì)胞，但明顯比第

17、3組少，生成的脂肪細(xì)胞巢也較少，第1組并無成熟脂肪細(xì)胞巢可見，只觀察到少量單個(gè)或數(shù)個(gè)脂肪細(xì)胞分布在支架內(nèi)部，油紅O染色切片鏡下觀察情況同HE切片;熒光顯微鏡下觀察可見第3組脂肪細(xì)胞聚集處有明顯的紅色熒光，第2組熒光較少，第1組并未見到紅色熒光;1、2、3組新生血管平均數(shù)分別為:(3.00±1.28)個(gè)/HP，(3.28±1.36)個(gè)/HP，(4.44±1.15)個(gè)/HP。經(jīng)隨機(jī)設(shè)計(jì)資料樣本均數(shù)間的多重比較P值分別為:1組和2組比較P=0

18、.514＞0.05;1組和3組比較P=0.001＜0.01;2組和3組比較P=0.008＜0.01;可見1組和2組之間血管密度并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而3組較前兩組差異有顯著性。
　　 結(jié)論:
　　 1.抽脂術(shù)獲得的脂肪組織能夠成功分離提取大量的多能干細(xì)胞，經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子表面標(biāo)記及多向分化鑒定證實(shí)為脂肪來源干細(xì)胞。該細(xì)胞容易獲取、可穩(wěn)定傳代、在相應(yīng)的誘導(dǎo)條件下能夠分化成為目的細(xì)胞，可作為脂肪組織工程理想的種子細(xì)胞;
　　

19、 2.將bFGF包被于PLA微球中，可以使微球中bFGF緩慢釋放進(jìn)入局部微環(huán)境，從而達(dá)到bFGF對(duì)周圍細(xì)胞持續(xù)發(fā)揮作用的目的。bFGF-PLA緩釋微球體外對(duì)ADSCs具有明顯的促增殖作用，同時(shí)也能夠明顯促進(jìn)ADSCs向脂肪細(xì)胞方向分化。
　　 3.人脂肪組織細(xì)胞當(dāng)中可提取細(xì)胞外基質(zhì)，提取的細(xì)胞外基質(zhì)具有容易獲取，形狀和顆粒體積具有高度的多樣性，表面積較大等優(yōu)點(diǎn)，有利于脂肪干細(xì)胞的粘附和增殖，可有望成為一種較理想的脂肪組織工程支架

20、材料。
　　 4.人ADSCs用Ad.EGFP和DiI熒光標(biāo)記后并不會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖生長產(chǎn)生影響，兩種標(biāo)記方式都適合ADSCs的體內(nèi)示蹤的應(yīng)用。ADSCs在體外與人脂肪組織ECM支架具有很好的生物相容性，粘附率較高，細(xì)胞增殖生長能力并不會(huì)受到影響。
　　 5.人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架聯(lián)合bFGF-PLA與ADSCs體內(nèi)能夠成功構(gòu)建出成熟的脂肪組織，細(xì)胞外基質(zhì)支架和bFGF-PLA體內(nèi)能夠顯著提高ADSCs成脂分化的效率和移