靜電紡絲納米纖維支架結(jié)合脂肪干細胞構(gòu)建組織工程尿道.pdf

1、組織工程是一門融合了多種學科知識的綜合性學科，是再生醫(yī)學的重要組成部分。組織工程的研究方法很多，但其基本策略包括種子細胞的選擇、支架材料的研制和細胞與支架的相互作用。
　　 脂肪組織是一種新的成體干細胞來源。因為取材方便、侵入小、產(chǎn)量大等優(yōu)點，脂肪干細胞已成為組織工程研究中一線種子細胞。許多研究表明，脂肪組織的生物學特性與解剖部位有關(guān)。脂肪干細胞來源于脂肪組織，其取材部位對細胞特性是否也存在這種相關(guān)性，目前尚無明確結(jié)論。人工合成

2、支架在組織工程研究中的地位越來越重要。高分子聚合物因其穩(wěn)定而可控的特性應用廣泛。聚乳酸質(zhì)脆，降解度高，而聚己內(nèi)酯質(zhì)韌，降解度低，兩者不同比例的復合物可提供各種性狀的支架。我們利用靜電紡絲技術(shù)制備了兩者的共混物，這種混合物支架由納米級纖維編織成三維結(jié)構(gòu)，適合模擬細胞外基質(zhì)。
　　 在本研究中，我們比較了不同解剖部位來源的脂肪干細胞特性，結(jié)果顯示兔腹股溝皮下部位是最佳取材部位。同時研究了聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混支架中兩種成分的混合比例對

3、其性能的影響，發(fā)現(xiàn)按1/1 比例制備的支架表現(xiàn)出更好的性能。在上述研究的基礎(chǔ)上，我們以脂肪干細胞為種子細胞，以1/1 比例的靜電紡絲聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混纖維為支架，通過細胞在支架上的平滑肌誘導，探索其構(gòu)建組織工程化尿道的可行性。
　　 第一部分不同解剖部位來源的脂肪干細胞生物學特性比較
　　 目的:研究并比較脂肪干細胞取材的解剖部位對脂肪干細胞生物學特性的影響，為脂肪干細胞作為組織工程種子細胞的選擇策略提供理論基礎(chǔ)。

4、r>　　 方法:5只同齡雌性新西蘭大白兔從出生起在同等環(huán)境中飼養(yǎng)，4月齡時用于實驗研究，平均體質(zhì)量約2.4kg(2.37～2.42kg)。經(jīng)耳緣靜脈麻醉后，每只兔在無菌術(shù)下于3個部位手術(shù)切取脂肪組織團塊，包括腹股溝皮下、頸背部皮下和腹膜后腎周部位。所得脂肪組織經(jīng)常規(guī)分離培養(yǎng)，按來源部位分為三個實驗組培養(yǎng)。三組脂肪干細胞分別用以下實驗方法比較生物學行為：(1)倒置相差顯微鏡下形態(tài)觀察和流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志物CD105和CD166以

5、鑒定細胞；(2)細胞計數(shù)法和MTT 法檢測細胞增殖能力；(3)標準曲線法和活死細胞染色檢測細胞活力；(4)組織化學染色（堿性磷酸酶染色和油紅染色）、Real-time PCR和Western blot 檢測成骨、成脂誘導分化能力。
　　 結(jié)果:
　　 (1)細胞鑒定：①三個部位的脂肪干細胞均呈典型間充質(zhì)干細胞形態(tài)，肉眼觀察未見明顯差異；②流式檢測三組細胞CD105、CD166 標志物，其陽性率未見統(tǒng)計學差異。
　　

6、 (2)增殖能力：①4天時皮下組織腹股溝和頸背部細胞數(shù)量均高于腹膜后腎周組，差異有顯著性。兩組皮下組織組之間無差異。7天時三組細胞數(shù)量未檢出統(tǒng)計學差異。②單因素方差分析比較三組細胞MTT法測定的增殖曲線，腹股溝皮下和頸背部皮下組細胞都較腹膜后腎周組有統(tǒng)計學差異，而兩者之間無差異。
　　 (3)細胞活力：①腹股溝組、頸背組、腹膜后組活細胞數(shù)量逐步遞減，組間兩兩比較均有差異。②三組細胞經(jīng)活死細胞染色計算的活細胞數(shù)量各組間比較未見統(tǒng)

7、計學差異。
　　 (4)分化能力：①定量堿性磷酸酶染色示腹股溝皮下來源脂肪干細胞成骨分化能力優(yōu)于另兩組，差別均有顯著性。定量油紅染色示三組細胞成脂分化能力相似。②Real-time PCR檢測成骨、成脂分化標志物均有表達，各組間比較顯示皮下部位（腹股溝和頸背部）來源的細胞表達量明顯高于腹膜后組，而皮下部位中腹股溝組優(yōu)于頸背部組。③Western blot 檢測到各標志物的蛋白表達，與Real-time PCR結(jié)果一致。
　

8、　 結(jié)論:
　　 (1)脂肪干細胞是一種典型的間充質(zhì)干細胞，其形態(tài)和表型均符合間充質(zhì)干細胞特征；
　　 (2)來源部位對脂肪干細胞的增殖、活力和分化能力有影響，皮下來源的細胞在各方面優(yōu)于腹膜后來源，同為皮下組織來源的腹股溝部位又優(yōu)于頸背部位；
　　 （3）腹股溝皮下部位是脂肪干細胞現(xiàn)對較理想的取材部位；
　　 （4）脂肪干細胞可向骨細胞、脂肪細胞分化，可應用于組織工程研究；
　　 （5）脂肪是一

9、種具有高度非均一性的組織，這種非均一性不僅存在于不同個體之間，也存在于同一個體不同部位之間。
　　 第二部分靜電紡絲聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混纖維支架與脂肪干細胞的生物相容性研究
　　 目的:研究利用靜電紡絲技術(shù)制備的聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混纖維的生物相容性，探討不同的重量混合比對該聚合物支架生物相容性的影響。
　　 方法:利用靜電紡絲技術(shù)將聚乳酸（PLLA）和聚己內(nèi)酯（PCL）的混合物（PLLA/PCL）制備成納米纖維支

10、架，兩種聚合物共混時的重量比為3/1,2/1,1/1(PLLA/PCL)。對這三種不同比例的支架進行形態(tài)學、孔隙率、體外降解率的比較；將納米纖維支架作為異物接種到大鼠背部皮下口袋中，以觀察局部炎癥反應，評價材料的組織相容性；以脂肪干細胞為種子細胞，接種到三種比例的支架上，檢測細胞的增殖、粘附、活力和多向分化（成骨分化、成軟骨分化、成脂分化）能力，評價材料的細胞相容性。
　　 結(jié)果:
　　 1.形態(tài)學觀察：（1）纖維直徑：

11、3/1 支架為1.25±0.27μm，2/1 支架為870±45nm，1/1 支架為452±24nm，1/1 支架較3/1，2/1 NFS 差異有非常顯著性；(2）孔隙率：三種比例支架孔隙率分別為78.3±3.4％，78.7±5.1％和82.2±4.8％，三者間未檢出統(tǒng)計學差異（3）降解率：根據(jù)降解曲線顯示，PLLA 含量越大，支架體外降解率越高。
　　 2.組織相容性：三種支架移植均導致炎性細胞浸潤，急性炎性反應過程約2周時間

12、，4周后炎癥反應消失。
　　 3.細胞相容性：脂肪干細胞可在支架上粘附、增殖并多向分化，脂肪干細胞與1/1 支架組裝的復合體有最好的生物學行為表現(xiàn)。
　　 結(jié)論:
　　 （1）PLLA和PCL的共混溶液可經(jīng)靜電紡絲技術(shù)制備具有納米結(jié)構(gòu)的纖維支架；
　　 （2）PLLA、PCL 混合的重量比率對兩者的靜紡共混纖維在形態(tài)、孔隙率、降解率有影響，1/1 比例的材料性能最優(yōu)；
　　 （3）靜紡PLLA/P

13、CL 支架生物相容性好，可作為組織工程候選支架材料。
　　 第三部分尿道組織工程：脂肪干細胞在靜電紡絲納米纖維支架上的平滑肌分化
　　 目的:研究脂肪干細胞在靜電紡絲聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混納米纖維支架上的平滑肌分化，探索該支架材料作為尿道組織工程的可行性。
　　 方法:靜電紡絲技術(shù)制備重量比為1：1的聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混納米纖維支架。從兔腹股溝皮下分離脂肪干細胞，接種到支架上組裝成為復合體。用平滑肌誘導培養(yǎng)基誘導支

14、架上的脂肪干細胞，通過形態(tài)學觀察、免疫熒光、細胞增殖檢測、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白印記和膠原收縮法比較脂肪干細胞在有無支架條件下誘導的平滑肌細胞有無差別。
　　 結(jié)果:誘導6周后，脂肪干細胞誘導的平滑肌細胞具有平滑肌細胞形態(tài)，能夠表達α-actin和MHC 兩種平滑肌標志物，胞體中F-actin 含量接近正常平滑肌細胞。細胞增殖顯示，誘導3周時，支架上誘導的平滑肌細胞數(shù)量較無支架誘導的細胞無差別，而在6周時，兩者有非常顯著性差別。基因轉(zhuǎn)錄

15、和蛋白表達均顯示誘導的脂肪干細胞能夠表達平滑肌特異性基因或蛋白，且支架對脂肪干細胞向平滑肌分化無影響。收縮功能檢測顯示誘導的平滑肌細胞具有很好的收縮能力。
　　 結(jié)論:
　　 （1）ASCs 可直接在靜電紡絲PLLA/PCL納米纖維支架上誘導分化為具有收縮功能的SMCs；
　　 （2）ASCs與NFS 構(gòu)建的復合體可用于尿道組織工程研究；
　　 （3）靜電紡絲PLLA/PCL納米纖維可作為平滑肌組織工程候