人脂肪組織細胞外基質支架的制備與檢測及其在大鼠軟組織缺損模型中降解的實驗研究.pdf

1、目的：⑴制備人脂肪組織細胞外基質支架并初步檢測其脫細胞效果、成分、機械性能等指標；⑵探討人脂肪組織細胞外基質支架對人脂肪間充質干細胞（hADSCs）的生物相容性及其對hADSCs成脂分化能力的影響；⑶建立大鼠軟組織缺損模型，探討人脂肪組織細胞外基質支架于缺損軟組織模型內生物降解性。
　　方法：①取正常脂肪組織約25g經反復凍融、酶消化、有機溶劑提取脂質、冷凍干燥等處理制備成人脂肪組織細胞外基質支架。大體觀察支架性狀，行HE、Mas

2、son染色、DAPI熒光染色觀察支架脫細胞效果；免疫組織化學染色觀察細胞外基質（Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白）保留情況；掃描電鏡觀察支架顯微結構；萬能力學試驗機測試支架機械性能；②利用酶消化法從人體健康脂肪組織中分離提取出hADSCs，擴增培養(yǎng)、觀察細胞形態(tài)、檢測細胞免疫表型；定向誘導hADSCs成脂及成骨分化，油紅O、茜素紅染色鑒定；取第3代hADSCs與人脂肪組織細胞外基質支架復合培養(yǎng)，CCK-8檢測細胞增殖活性；掃描電鏡觀察細胞粘附情

3、況并成脂誘導，14d后行細胞支架復合物冰凍切片，油紅O染色，RT-PCR檢測成脂特異性基因PPARγ、LPL mRNA表達情況；③取清潔級雌性Wistar大鼠18只，于左側背部切除豎脊肌部分肌肉，建立軟組織缺損模型，分別于4w、8w、12w觀察肌肉缺損愈合情況；另取清潔級雌性Wistar大鼠18只，于左側背部建立軟組織缺損模型，將支架植入其中；右側直接將支架植入皮下；分別于4w、8w、12w取出植入支架，大體觀察兩側支架降解情況，比較兩

4、組支架濕重，行HE染色觀察支架內炎性浸潤情況。
　　結果：⑴脂肪組織細胞外基質支架呈海綿樣多孔結構；HE及Masson染色未見明顯細胞結構，可見排列緊密的基質蛋白；DAPI熒光染色未見明顯陽性細胞核，脫細胞徹底；免疫組織化學染色顯示支架材料Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白染色呈陽性結果；掃描電鏡觀察支架呈多孔泡沫樣結構，孔隙相互連接，孔徑約50-60μm；萬能力學試驗機測定支架最大載荷值低于脂肪組織；⑵膠原酶消化法可成功從脂肪組織中分離培

5、養(yǎng)出hADSCs，細胞貼壁生長，原代呈短梭形，傳代培養(yǎng)后呈長梭形；流式細胞儀檢測免疫表型，其中CD44、CD90陽性，CD34、CD45陰性；hADSCs成脂、成骨定向誘導分化后，油紅O、茜素紅染色陽性。細胞與支架復合培養(yǎng)后，CCK-8檢測顯示A值隨時間延長不斷升高，細胞生長良好，基質支架對細胞無毒性；掃描電鏡可見大量細胞粘附于支架；成脂誘導支架細胞復合物，油紅O染色可見支架內大量紅染脂滴；RT-PCR顯示LPL、PPARγmRNA顯著

6、高表達；⑶大鼠軟組織缺損模型建立后，分別于4w、8w、12w觀察可見軟組織缺損持續(xù)存在，未能自行填充修復；將支架植入組織缺損及皮下后分別于4w、8w、12w取材，可見植入組織缺損處支架及皮下支架表面皆形成包膜，通過大體觀察，比較濕重，可見缺損組支架降解明顯快于皮下組，HE染色缺損組支架炎性浸潤明顯高于皮下組,兩組支架均未完全降解。
　　結論：①利用脫細胞技術制備的人脂肪組織細胞外基質支架脫細胞徹底，具有良好的三維空間結構，細胞外基