脂肪組織來源干細胞輔助自體脂肪組織游離移植后早期調(diào)控再血管化的機制.pdf

1、研究背景和目的：
　　 就目前整形美容的發(fā)展來看，自體脂肪移植已經(jīng)廣泛運用于美容整形和修復創(chuàng)傷導致的軟組織缺損的修復，其發(fā)展歷史可以追溯到19世紀。在1911年，Bruning被最先報道將自體脂肪注射到皮下用于軟組織的填充。隨著抽脂技術的不斷成熟，自體脂肪組織容易獲取，不在供區(qū)和受區(qū)留下瘢痕，且不產(chǎn)生免疫排除反應、不會引起交叉感染，所以自體脂肪組織可以作為一種理想的軟組織填充劑。
　　 但是自體脂肪移植的臨床應用受到移植

2、脂肪存活率的限制，根據(jù)長時間的隨訪觀察，移植脂肪最終的存活率為20-80％。在移植的早期，移植脂肪和受區(qū)之間尚未建立血供，脂肪組織只能靠周圍組織滲出的組織液提供營養(yǎng)，滲出距離僅為100-200μm。此時移植脂肪處于急性缺氧缺血的狀態(tài)，移植脂肪中央?yún)^(qū)出現(xiàn)大量脂肪的壞死，隨后壞死的脂肪組織被纖維結締組織取代。由此可見，在自體脂肪移植中，在移植后的早期及時、充分的血供建立，對于移植脂肪的存活是非常重要的。目前細胞療法被應用于自體脂肪移植，特別

3、是脂肪組織來源干細胞（adipose-derived stem cells，ASCs）輔助自體脂肪游離移植。
　　 Yoshimura等人研究細胞輔助的脂肪移植，他們將包含有ASCs的血管基質(zhì)片段混合脂肪一起移植，發(fā)現(xiàn)細胞輔助移植比對照組存活率高。本課題組前期的研究也表明，ASCs混合脂肪移植可促進再血管化，從而提高移植脂肪的存活率。目前為止，ASCs輔助自體脂肪游離移植，被證實可以有效的提高移植脂肪的存活率。但是ASCs在脂肪

4、移植中究竟發(fā)揮了怎樣的作用，是通過什么機制促進游離脂肪的存活，這些問題都沒有明確的答案。本實驗圍繞以下幾個科學問題展開:(1) ASCs輔助自體脂肪游離移植，在形態(tài)學方面移植的早期移植脂肪發(fā)生怎樣的變化？(2) ASCs調(diào)控移植脂肪再血管化的主要機制？
　　 本實驗首先針對單純自體脂肪移植和ASCs輔助自體脂肪移植后早期不同時間點，通過檢測移植脂肪的存活率和HE染色切片，對移植脂肪組織學的變化進行比較研究，再應用ELISA等技術

5、來探討ASCs調(diào)控移植脂肪再血管化、提高移植脂肪存活率的主要機制。
　　 方法：
　　 1、ASCs的分離和培養(yǎng)
　　 將抽脂所得的脂肪用PBS反復沖洗3次，再用0.125％Ⅰ型膠原酶于37℃水浴消化30min，期間反復震蕩3次。用與膠原酶消化后的混懸液等體積的完全培養(yǎng)液（高糖DMEM+10％胎牛血清+1％雙抗）終止消化，200目濾網(wǎng)過濾，1200g離心5min以去除懸浮的脂肪細胞、脂滴等，去上清。將細胞沉淀用1

6、ml的完全培養(yǎng)液重懸后，加入6倍體積的紅細胞裂解液，混勻后室溫下孵育6min，1200g/min離心5min，去上清，再以適量完全培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于培養(yǎng)皿，再加入適量完全培養(yǎng)液，置于37℃、5％ CO2孵箱培養(yǎng)。細胞每3天換一次培養(yǎng)，每周以1∶3的比例傳代。本實驗用的ASCs均為第三代細胞。
　　 2、單純自體脂肪游離移植和ASCs輔助自體脂肪游離移植的模型制備及移植脂肪存活的評價
　　 將24只裸鼠背部左、右側隨機

7、分為A、B組(n=36)，采用Coleman技術分別于A、B組裸鼠背部皮下移植含5×105個ASCs的脂肪0.5 mL和脂肪0.5mL。移植后1、5、7、14、30、90d分別取6只裸鼠，取出移植脂肪組織，進行以下觀測:(1)移植脂肪的大體觀察;(2)移植脂肪的體積及存活率;(3) HE染色切片。
　　 3、ASCs調(diào)控移植脂肪再血管化的檢測
　　 將各個時間點的兩組移植脂肪進行一下指標的檢測:(1)ELISA檢測VEG

8、F(vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮生長因子)和HGF(hepatocyte growthfactor，肝細胞生長因子)的表達;(2)統(tǒng)計學分析。
　　 4、統(tǒng)計學處理
　　 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，使用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行數(shù)據(jù)處理。兩組之間比較采用配對t檢驗;組內(nèi)不同時間點的差異采用方差分析;完全隨機設計資料的多樣本均數(shù)比較采用LSD檢驗。
　　

9、 結果：
　　 1.移植后早期不同時間點兩組移植脂肪存活率:A組:1天(63.67±4.97)％，4天（67.33±7.66）％，7天(74.67±4.13)％，14天(79.67±8.73)％，30天（64.33±7.53）％，90天（55.00±6.78）％;B組:1天(61.33±1.63)％，4天(65.00±4.86)％,7天(74.33±4.97)％，14天(80.17±8.64)％,30天（54.67±7.55）

10、％，90天(42.67±6.77)％。移植后早期不同時間點兩組采用配對t檢驗比較，在1-14天兩組移植脂肪存活率沒有顯著性差異(P＞0.05)，在30天和90天A組存活率明顯高于B組(P=0.001，P=0.006)移植后隨著時間的變化兩組均采用方差分析，發(fā)現(xiàn)1-14天兩組移植脂肪存活率稍有增高的趨勢，隨后開始明顯的下降(P＜0.05)。
　　 2.移植后早期不同時間點兩組移植脂肪組織學的變化:移植后一周內(nèi)，兩組移植脂肪組織中央

11、區(qū)可見少量的空泡、囊腔樣改變，脂肪細胞的數(shù)量和大小無明顯變化。移植后兩周，移植脂肪組織中央?yún)^(qū)可見更多的壞死脂肪細胞，融合成空泡，且脂肪細胞大小不一。脂肪細胞間距逐漸變寬，且有大量的有核細胞的浸潤，此現(xiàn)象在移植后第14天最為明顯。在移植后第4天，A組在移植脂肪的表面可見到有血管從移植脂肪組織的包膜長入，但這個現(xiàn)象B組在移植后第7天才出現(xiàn)。隨著時間推移，移植物血管的數(shù)量逐漸增加，且血管向移植脂肪組織中央?yún)^(qū)生長，但A組血管數(shù)量明顯多于B組。在

12、移植后30天，兩組移植脂肪中均出現(xiàn)不同程度的纖維化，B組較A組更為嚴重。
　　 3.①ELISA檢測不同時間點VEGF表達:A組在移植后第4天，VEGF的表達達到高峰，并一直持續(xù)到第14天，隨后開始下降;B組VEGF高峰出現(xiàn)的時間較A組晚，于第7天出現(xiàn)，隨后逐漸下降。②ELISA檢測不同時間點HGF表達:HGF的高表達在A、B組均出現(xiàn)在第7天，并維持到第14天，隨后逐漸下降，A組表達量始終高于B組。
　　 討論：

13、　　 先天性或后天獲得性軟組織缺損的修復，是整形外科面臨的非常重要的課題之一，目前被廣泛應用的方法有人工合成材料的填充植入、真皮脂肪瓣的游離移植等。但以上方法均存在不同的缺點，如供區(qū)損傷、組織壞死、排斥反應、材料吸收等。自體脂肪組織移植具有易獲取、無免疫排斥反應、供受區(qū)損傷小等特點，因此自體脂肪組織成為理想的軟組織填充劑。然而，對于自體脂肪組織移植的遠期的吸收率的報道尚不一致(20-80％)，限制其在臨床的廣泛應用。
　　 因

14、此，自體脂肪游離移植后，早期充分的血管建立對于保證移植脂肪組織高的存活率十分重要。移植后2周內(nèi)兩組移植脂肪組織存活率有增加，我們考慮是這時期大量的脂肪細胞壞死，釋放出脂滴，組織水腫，大量有核細胞浸潤，這些組織學上的變化會導致移植后早期脂肪組織體積的增加。在移植后的早期兩組移植脂肪組織在大體觀察及存活率上無統(tǒng)計學差異，這說明在自體脂肪游離移植后的早期，移植脂肪組織的變化主要是發(fā)生于組織結構而不是存活率。
　　 關于移植脂肪組織最終

15、的轉歸，存在兩種理論:一種是“宿主取代論”，另一種是“細胞存活論”。“宿主取代論”指的是宿主的組織細胞（可能是巨噬細胞）浸潤，吞噬壞死脂肪細胞釋放出的脂質(zhì)，最終取代移植脂肪中的脂肪細胞?！凹毎婊钫摗敝傅氖侵疽浦埠?，移植脂肪組織中部分存活的細胞，長期存活。后一種理論被廣泛接受。因此，大多數(shù)學者認為移植脂肪組織中存活脂肪細胞的數(shù)量與最終存活脂肪的體積相關，所以在純化和最大化存活脂肪細胞的數(shù)目上做出了很多的努力。有研究指出，在距離移植脂肪

16、組織邊緣300微米以內(nèi)的細胞（包括脂肪細胞和ASCs）基本均可以存活，這個區(qū)域稱之為“存活區(qū)”。向內(nèi)靠近的第二區(qū)域為“再生區(qū)域”，此區(qū)域組織的存活依賴于再血管化的程度以及與周圍組織接觸的情況。在這個區(qū)域內(nèi)的脂肪細胞在移植后的第1天就死亡，但是ASCs可以存活下來分化為新的脂肪細胞代替死亡的脂肪細胞。最核心的區(qū)域為“壞死區(qū)域”，這個區(qū)域的脂肪細胞和ASCs均死亡，無脂肪再生的發(fā)生，壞死脂肪液化被吸收，由纖維結締組織填充或形成鈣化。

17、　　 研究表明在游離脂肪移植后的第4天，就可以觀察到從宿主血管出現(xiàn)血管新生長入移植脂肪組織。這與我們的實驗結果相一致，而且在移植后的2周內(nèi)，相對于單純脂肪移植組，ASCs輔助脂肪移植組的組織學觀察顯示出移植脂肪組織中更高的血管密度。我們還發(fā)現(xiàn)在移植脂肪組織中，新生血管越密集的區(qū)域，就有越多的炎癥細胞浸潤。這個現(xiàn)象可能與巨噬細胞的浸潤存在相關關系，可能促進血管生成。另外有研究表明，在腫瘤組織中當巨噬細胞暴露在缺氧的環(huán)境下，巨噬細胞的表型

18、可發(fā)生變化，并激活多種促增殖和血管生成細胞因子和酶的表達。
　　 兩組移植脂肪組織存活率無統(tǒng)計學差異，但是在組織學上ASCs輔助脂肪移植組表現(xiàn)出更好的血管化，這可能跟ASCs的旁分泌機制相關。脂肪抽吸和注射的過程會對脂肪組織造成機械性的損傷，并且移植過程中以及移植后的缺血缺氧也會對脂肪組織造成損傷。在面對這樣機械性損傷，或者缺血缺氧的環(huán)境中，ASCs可分泌多種促血管生成生長因子如VEGF、HGF以及bFGF等。在缺氧的環(huán)境下(2

19、％O2)，ASCs的細胞增殖能力和分泌促血管生成生長因子(如VEGF、bFGF)的能力都顯著提高。還有其他的研究也得出相似的結論，在缺血缺氧的環(huán)境中，促血管生成生長因子mRNA的表達增加了1.7-4.1倍。在Wistar大鼠的游離脂肪移植模型中，VEGF在間質(zhì)單核細胞中的表達在移植后7天出現(xiàn)最高峰，隨后逐漸下降。這與我們的研究結果相符合，ASCs輔助脂肪移植時ASCs可促進VEGF的分泌高峰提前到移植后第4天。在人脂肪組織受到機械性損傷

20、后，在創(chuàng)傷愈合的早期，首先釋放的是FGF-2、TGF-β以及PDGF等，在這些生長因子的表達量開始下降后，在損傷后的1周VEGF和HGF的分泌才逐漸增高。在損傷或者缺血缺氧的環(huán)境中，受損傷的組織釋放出大量的FGF-2，F(xiàn)GF-2通過JNK信號通路刺激ASCs的增殖和分泌HGF。因此在我們的研究中，ASCs輔助脂肪移植組中HGF在移植后一直維持一個較高的分泌水平，可能是因為充足的外源性的ASCs在缺血缺氧的環(huán)境中釋放大量的HGF，使得HG

21、F在移植后的早期就維持在一個較高分泌水平。而單純脂肪移植組HGF的分泌增多在移植后第14天，我們考慮可能是因為移植后受損傷的受區(qū)組織和脂肪組織先釋放FGF-2，F(xiàn)GF-2再調(diào)控HGF分泌，使HGF的釋放在移植一周后才開始增多。有研究證實，在體外缺血缺氧的條件下ASCs只能存活3天。在脂肪移植后的1周內(nèi)大部分的ASCs會因為缺血缺氧而壞死。因此，ASCs通過旁分泌機制促血管生成的作用主要是發(fā)生在脂肪移植后2周內(nèi)。
　　 結論：

22、r>　　 1.在移植后的早期（2周內(nèi)），單純自體脂肪游離移植和ASCs輔助自體脂肪游離移植，兩組移植脂肪組織學結構的差異并未在大體觀和存活率上體現(xiàn)出來，移植后炎性細胞浸潤和組織水腫導致移植脂肪的體積增加。
　　 2.ASCs輔助脂肪移植較單純脂肪移植呈現(xiàn)出更好的再血管化，雖然在脂肪后的早期對移植脂肪的存活率并沒有影響，但是對移植后30天移植脂肪的存活率產(chǎn)生明顯影響。
　　 3.ASCs輔助脂肪移植的再血管化較單純脂肪移