人腎小管上皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧性損傷的蛋白質(zhì)組學(xué)改變.pdf

1、目的：采用將人腎小管上皮細(xì)胞置于缺氧環(huán)境中然后復(fù)氧的方法來模擬缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）所致腎損傷的發(fā)生和發(fā)展過程，并采用“蛋白質(zhì)組學(xué)”的研究方法，通過雙向凝膠電泳、質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)等技術(shù)方法，獲得對照組、IR性腎損傷組的腎小管上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)圖譜。通過對這些圖譜進(jìn)行相互的差異分析并結(jié)合INTERNET數(shù)據(jù)庫資料，以尋找IR性腎損傷相關(guān)的腎小管上皮細(xì)胞特異表達(dá)或異常表達(dá)的蛋白成分。 方法：人腎

2、小管上皮細(xì)胞株（HK-2）按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；隨機分為IR組、人參皂甙（ginsenosides，GS）+IR組、對照組。其中IR組放入三氣培養(yǎng)箱（94%N2、5%CO2、1%O2）中缺氧培養(yǎng)8h，然后于5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)24h；GS+IR組按5μg/ml培養(yǎng)液（最佳藥物濃度）加入GS，放入三氣培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)8h，然

3、后于5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)24h；對照組于5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。采用常規(guī)的細(xì)胞裂解法（裂解液由8 mol/L尿素，1% TBP，4% CHAPS，0．2% Bio-Lyte組成）裂解細(xì)胞，提取全細(xì)胞蛋白。Bradford法測定蛋白質(zhì)含量，雙向電泳分離蛋白質(zhì)。第一向采用pH4-7的固相pH梯度（IPG）等電聚焦，第二向采用濃度為10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。銀染并經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)采集獲得雙向電泳圖譜，根據(jù)IPG膠條的

4、pI線性梯度和標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker，確定蛋白質(zhì)斑點的pI和MW，用ImageMaster2D Platinum v5．0分析軟件對實驗組和對照組的蛋白質(zhì)電泳圖譜進(jìn)行差異分析，篩選出10個具有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。切取蛋白質(zhì)斑點，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）進(jìn)行檢測，獲得各蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜，結(jié)合2-DE圖譜中各蛋白質(zhì)點的pl和MW值，利用Mascot軟件進(jìn)行匹配檢索GenBank數(shù)據(jù)庫來鑒定蛋白質(zhì)。

5、 結(jié)果：①IR組與對照組及人參皂甙+IR組的表達(dá)蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜相比較存在明顯的差異，表現(xiàn)為圖譜中蛋白質(zhì)斑點數(shù)目及灰度值的改變。②利用質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)，鑒定了10個與HK-2缺氧復(fù)氧性損傷相關(guān)的蛋白質(zhì)，其中1個為膜蛋白，其余9個為胞漿或胞核蛋白。這些蛋白質(zhì)的生理功能涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗細(xì)胞損傷、細(xì)胞骨架等。 結(jié)論：①IR組與對照組及人參皂甙+IR組的表達(dá)蛋白質(zhì)組相比較存在明顯的差異。②經(jīng)質(zhì)譜