人結(jié)腸上皮衰老機制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、人類的結(jié)腸具有吸收和分泌的重要機能，參與機體對水、電解質(zhì)平衡的調(diào)節(jié)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。結(jié)腸的上皮細(xì)胞是致病因子與外環(huán)境作用于機體的主要靶細(xì)胞之一，也是機體許多病理變化的始發(fā)環(huán)節(jié)及主要病灶所在。衰老(aging)通常被定義為機體的正常生理功能隨著年齡的增長而緩慢減退的過程，它是一種正常的、復(fù)雜的、不可逆的生物學(xué)過程，是機體的功能發(fā)生衰退及生理功能紊亂的綜合表現(xiàn)。結(jié)腸上皮同樣會隨著年齡的增長而出現(xiàn)生理功能逐漸減退，同時惡性腫瘤等多種腸道疾病的

2、發(fā)病率明顯升高。針對結(jié)腸上皮的衰老機制，國內(nèi)外也已開展了許多相關(guān)的研究：Lopes等人觀察到衰老大鼠的結(jié)腸平滑肌細(xì)胞線粒體的形態(tài)和功能都發(fā)生了改變；Ono等人發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，消化道上皮的DNA突變頻率增加，而以結(jié)腸的突變頻率最高；Tsurudome等發(fā)現(xiàn)，在老年人的結(jié)腸癌組織中8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-hydroxydeoxyguanosine)的水平升高，提示氧自由基對結(jié)腸上皮細(xì)胞DNA的損傷程度增加。 以往的這些研究雖然

3、揭示了一些結(jié)腸上皮衰老以及衰老結(jié)腸上皮對癌癥易感的機理，但是這些研究多數(shù)是從某個或某幾個基因出發(fā)，而結(jié)腸上皮的衰老是一個漸進的、多基因、多因素參與的復(fù)雜過程。另外，以往研究多集中在DNA和RNA水平，但由于基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的復(fù)雜性，DNA和RNA水平的變化并不能完全反映蛋白質(zhì)水平的變化，而蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行分子，并且蛋白質(zhì)的翻譯后修飾狀況、蛋白質(zhì)的相互作用、蛋白質(zhì)的動態(tài)變化等信息僅通過基因組研究是無法獲知的。傳統(tǒng)的對單個蛋白質(zhì)的研

4、究方式和研究技術(shù)已無法滿足后基因組時代里對衰老這類復(fù)雜生命現(xiàn)象的研究要求，而以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)為研究對象的蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)則為衰老研究提供了新的研究思路和技術(shù)。差異表達蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個重要研究內(nèi)容，與試圖了解細(xì)胞內(nèi)所有的表達蛋白質(zhì)一“表達蛋白質(zhì)組學(xué)”不同的是，差異表達蛋白質(zhì)組學(xué)研究更多的是關(guān)注于細(xì)胞在不同生理、病理狀態(tài)下的差異表達蛋白質(zhì)，以期尋找或發(fā)現(xiàn)不同生理或病理狀態(tài)下的特征性蛋白質(zhì)。為此，本研究以青年人和老年人的正常

5、結(jié)腸粘膜上皮組織為研究對象，采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和方法來研究人類結(jié)腸上皮衰老相關(guān)的蛋白質(zhì)，為闡明結(jié)腸上皮衰老的分子機制提供有意義的線索。首先抽提制備青年組和老年組的結(jié)腸粘膜上皮組織的總蛋白質(zhì)，再應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)建立了重復(fù)性和分辨率均較好的青年組和老年組結(jié)腸粘膜上皮組織總蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳圖譜。經(jīng)銀染顯色，ImageScanner掃描儀掃描凝膠,PDQuest圖像分析軟件對兩組的組織總蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進行了比較，識別兩組差異表

6、達的蛋白質(zhì)點47個，再聯(lián)合采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS)對差異表達的蛋白質(zhì)進行分析，獲取MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖譜及ESI-Q-TOF肽序列標(biāo)簽，再經(jīng)Mascot軟件搜索SWISS-PROT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫鑒定了其中的38個差異表達的蛋白質(zhì)。 為了驗證比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果，采用Real-time quantitativeRT-PCR和West

7、ern blot分析以及免疫組織化學(xué)技術(shù)對部分差異表達蛋白質(zhì)在青年組和老年組結(jié)腸粘膜上皮組織中的表達水平進行了檢測，其結(jié)果與比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究的結(jié)果一致。 為了進一步驗證比較蛋白質(zhì)組學(xué)篩選到的差異蛋白質(zhì)是否為真正的與衰老相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，本文采用D-半乳糖誘導(dǎo)方法建立NIH/3T3細(xì)胞復(fù)制性衰老模型，應(yīng)用Western blot檢測2個差異蛋白質(zhì)(EF-Tu、Rhodanese)在衰老NIH/3T3細(xì)胞中的表達變化，觀察到EF-

8、Tu和Rhodanese在衰老NIH/3T3細(xì)胞中的表達水平顯著下調(diào)，說明EF-Tu和Rhodanese表達下調(diào)可能與體外細(xì)胞衰老有關(guān)。 本研究在建立青年組和老年組結(jié)腸粘膜上皮組織總蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的基礎(chǔ)上，采用質(zhì)譜分析結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索共鑒定出38個差異表達蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)按功能主要可以分為九類，即抗氧化蛋白質(zhì)、信號傳導(dǎo)類蛋白質(zhì)、與凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)、分子伴侶、與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)蛋白質(zhì)、基本代謝相關(guān)的酶類、轉(zhuǎn)錄與翻譯相關(guān)蛋白質(zhì)、能量