自噬通路在泛素連接酶Hrd1介導(dǎo)的α1-抗胰蛋白酶Z突變體降解中的作用.pdf

1、α1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,AAT)屬于絲氨酸蛋白酶超家族成員,由肝細(xì)胞合成和分泌,可以抑制包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶等多種蛋白酶活性,但其主要作用是通過血液循環(huán)到達(dá)肺部,保護(hù)肺組織彈力纖維免受中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的水解和破壞。AAT缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳病,由于編碼AAT蛋白的基因突變而引起AAT分泌障礙所致,其中最常見的突變?yōu)閆型突變,占臨床病例的95％以上,該突變編碼的蛋白為AAT Z突變體(α1-an

2、titrypsin Z variant,ATZ)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),泛素連接酶Hrd1可促進(jìn)泛素-蛋白酶體通路介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ATZ降解,且Hrd1顯著降低SDS不溶性和多聚體ATZ的水平。
　　目的:
　　觀察Hrd1是否可以通過自噬通路介導(dǎo)ATZ降解,同時探究其相關(guān)作用機制。
　　方法:
　　1.利用免疫熒光雙標(biāo)觀察細(xì)胞形態(tài)和蛋白定位情況;
　　2.分別加入放線菌酮(cycloheximide,CHX)抑

3、制蛋白質(zhì)的合成,MG132抑制蛋白酶體活性,HBSS培養(yǎng)液誘導(dǎo)自噬,BFA1和氯化銨抑制自噬;
　　3.利用siRNA技術(shù),合成Hrd1-siRNA抑制內(nèi)源性Hrd1表達(dá),觀察ATZ降解的情況;
　　4.real-time PCR技術(shù)檢測共表達(dá)Hrd1和ATZ后對自噬相關(guān)基因Atg5,Atg12和Beclin-1的影響;
　　5.免疫共沉淀方法(Co-immunoprecipitation,Co-IP)檢測ATZ與K4

4、8位泛素、p62之間的相互作用。
　　結(jié)果:
　　1.自噬參與Hrd1介導(dǎo)的ATZ降解
　　1.1 Hrd1促進(jìn)ATZ與自噬體膜蛋白LC3共定位
　　哺乳動物細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的LC3,即18kDa的LC3-I和16kDa的LC3-II。LC3-I廣泛分布于胞漿中,當(dāng)自噬發(fā)生時,Atg7活化 LC3并促使 LC3與Atg3結(jié)合,LC3-I與磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine,PE)結(jié)合

5、稱為LC3-II,LC3-II定位于自噬體膜的兩側(cè)。LC3-II的含量或 LC3-II/LC3-I的比例與自噬泡的數(shù)量呈正相關(guān)。因此為了了解ATZ、Hrd1和細(xì)胞自噬體膜蛋白LC3在細(xì)胞內(nèi)的定位情況,HEK293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd1,并用NH4Cl抑制溶酶體酶活性,同時設(shè)立DMSO組作為對照,細(xì)胞爬片免疫染色。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示在氯化銨抑制溶酶體后,共表達(dá)ATZ和Hrd1可使細(xì)胞漿中的LC3-II發(fā)生大量的點狀聚集,且Hrd1

6、可促進(jìn)ATZ與LC3共定位,提示Hrd1可能介導(dǎo)ATZ到達(dá)溶酶體中降解。
　　1.2自噬誘導(dǎo)和抑制對Hrd1介導(dǎo)ATZ降解的影響
　　為了進(jìn)一步確定 Hrd1是否介導(dǎo) ATZ通過自噬途徑降解,我們在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染 ATZ和Hrd1后,首先我們使用放線菌酮(cycloheximide,CHX)來阻斷ATZ蛋白的合成,再分別加入自噬誘導(dǎo)劑 HBSS和自噬抑制劑巴佛洛霉素 A1(Bafilomycin A1,BFA1),設(shè)立

7、空載體對照,免疫印跡檢測細(xì)胞內(nèi)ATZ水平變化。實驗結(jié)果顯示,與DMSO組相比,饑餓誘導(dǎo)自噬后,Hrd1能夠顯著下調(diào)ATZ的蛋白水平;溶酶體抑制劑BFA1可部分抑制Hrd1的作用。
　　1.3抑制內(nèi)源性Hrd1表達(dá)對ATZ自噬降解的影響
　　293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染 ATZ和Hrd1-siRNA,設(shè)立空載體對照,觀察內(nèi)源性 Hrd1表達(dá)抑制后對ATZ自噬降解的影響。免疫印跡結(jié)果顯示,與對照組相比,抑制內(nèi)源性Hrd1的表達(dá)使細(xì)胞內(nèi)A

8、TZ水平增高。
　　1.4 Hrd1對ATZ的自噬降解與其E3活性有關(guān)
　　為了進(jìn)一步明確Hrd1介導(dǎo) ATZ的自噬降解是否與其E3活性有關(guān),我們分別將HEK293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd1或Hrd1C1A的cDNA,24 hrs后在細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中加入BFA1,然后檢測細(xì)胞內(nèi)的ATZ水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Hrd1C1A不能促進(jìn)ATZ的降解,加入BFA1后細(xì)胞內(nèi)ATZ水平也無明顯變化。提示Hrd1介導(dǎo)的ATZ自噬降解與其E3活

9、性有關(guān)。
　　1.5 Hrd1介導(dǎo)不溶性ATZ通過自噬降解
　　以前的研究發(fā)現(xiàn)Hrd1在降低ATZ總體水平的同時輕度增加SDS可溶性ATZ水平,顯著降低SDS不溶性和多聚體ATZ的水平,且有研究發(fā)現(xiàn)自噬通路主要降解ATZ的聚集體部分,據(jù)此我們推測Hrd1是否介導(dǎo)不溶性ATZ通過自噬通路降解。為了驗證這一設(shè)想,我們用免疫印跡實驗分別檢測細(xì)胞上清和沉淀中的ATZ,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),Hrd1能明顯降低沉淀中ATZ的水平,而加入NH4C

10、l后抑制了Hrd1介導(dǎo)的ATZ降解,該結(jié)果提示Hrd1可通過自噬通路介導(dǎo)不溶性ATZ降解。
　　1.6Hrd1對自噬相關(guān)基因Atg5,Atg12和Beclin-1的影響
　　通常情況下,細(xì)胞自噬的發(fā)生依賴于一系列Atg家族蛋白,其中Beclin1是酵母Atg6/Vps30基因在哺乳動物中的同源物,通過與ClassⅢ PI3K形成復(fù)合物參與自噬體初期自噬體膜的形成;另外,Atg5在細(xì)胞內(nèi)形成Atg12-Atg5復(fù)合物,能促使L

11、C3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)變,對自噬體膜的延伸至關(guān)重要。為了進(jìn)一步驗證Hrd1對自噬的影響,我們在HEK293T中共表達(dá)ATZ與Hrd1,提取RNA進(jìn)行real-time PCR檢測Atg5、Atg12以及Beclin1的mRNA水平。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),共表達(dá)ATZ和Hrd1明顯增加自噬相關(guān)基因Atg5、Atg12的mRNA水平,Beclin1水平也有所提高。
　　2.Hrd1促進(jìn) ATZ K48位點泛素化
　　泛素是一個由76

12、個氨基酸組成的高度保守的多肽鏈,因其廣泛分布于各類細(xì)胞而得名。泛素共價地結(jié)合于底物蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基,被泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)將被特異性地識別并迅速降解。靶蛋白的泛素化降解是一個涉及E1泛素激活酶,E2泛素結(jié)合酶,以及E3泛素連接酶的酶促反應(yīng)。一個泛素分子內(nèi)部的七個賴氨酸殘基(K6,K11,K27,K29,K33,K48,K63)之一和前面的泛素分子形成一個多聚泛素鏈。不同的泛素化連接方式有不同的生物學(xué)功能,例如 K48連接的多泛素鏈介導(dǎo)泛素

13、化靶蛋白進(jìn)行蛋白酶體降解,K63連接的多泛素化最近已經(jīng)顯示出參與多種細(xì)胞過程,包括細(xì)胞內(nèi)吞作用,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和DNA損傷的調(diào)節(jié)等與蛋白酶體無關(guān)的作用。為了探究Hrd1介導(dǎo)ATZ的泛素化方式,HEK293T共轉(zhuǎn)染Hrd1和ATZ,加入自噬抑制劑BFA1,免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示Hrd1和ATZ可以與K48共定位,而與K63無共定位。免疫共沉淀結(jié)果提示ATZ與Hrd1以及K48可能存在相互作用,Hrd1可能促進(jìn)ATZ的K48位泛素化。
　　3

14、.p62參與Hrd1介導(dǎo)的ATZ的自噬通路降解
　　3.1 Hrd1與ATZ及p62共定位
　　p62是自噬發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用的蛋白。大量研究結(jié)果表明:泛素化的蛋白能夠通過p62的UBA結(jié)構(gòu)域與p62發(fā)生結(jié)合,而 p62又可通過其自身的LIR區(qū)域與自噬體膜蛋白LC3直接相互作用形成三者的復(fù)合物,并由LC3轉(zhuǎn)運至自噬體,最后通過自噬體/溶酶體降解,p62本身也能被自噬降解,故 p62可作為自噬活性的標(biāo)志分子。前述實驗已經(jīng)

15、證實Hrd1可以泛素化ATZ,我們想知道泛素化的ATZ是否與p62相互作用。首先我們在293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd1,24 hrs后加入自噬抑制劑BFA1,6 hrs后固定細(xì)胞,免疫熒光染色標(biāo)記ATZ、Hrd1和p62三種蛋白,激光共聚焦顯微鏡觀察三者在細(xì)胞內(nèi)的定位情況,結(jié)果顯示三者在細(xì)胞內(nèi)共定位。
　　3.2 ATZ與p62相互作用
　　為了進(jìn)一步證實Hrd1、ATZ與p62之間的相互作用,293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd