類胰蛋白酶激活小膠質細胞PAR2介導的神經毒性作用.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的固有免疫細胞，其在維持中樞神經系統(tǒng)微環(huán)境的動態(tài)平衡中扮演重要角色。近年來，研究認為神經元-小膠質細胞的神經網(wǎng)絡失衡與神經元損傷及中樞神經系統(tǒng)退行性疾病密切相關。其中，小膠質細胞活化后介導的神經炎癥反應和氧化損傷已成為中樞神經系統(tǒng)疾病的研究熱點之一。目前，越來越多的研究證實活化的小膠質細胞可促進一氧化氮(nitricoxide，NO)、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis

2、factor-α，TNF-α)等炎癥因子的釋放。然而，小膠質細胞活化的調控及其介導神經炎癥反應的分子機制十分復雜，尚待進一步研究闡明。
　　 蛋白酶激活受體2(protease-activatedreceptor2，PAR2)是與G蛋白相偶聯(lián)的受體，屬于蛋白酶激活受體(protease-activatedreceptors，PARs)家族成員之一，主要被胰蛋白酶和類胰蛋白酶等激活，其獨特的激活方式及廣泛的病理生理作用，使其有望作

3、為重要的藥物干預靶點而受到越來越多關注。近年來，研究發(fā)現(xiàn)PAR2廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)，在中樞神經系統(tǒng)損傷和退行性疾病等病理過程中扮演重要角色。目前，研究人員普遍認為在中樞神經系統(tǒng)中PAR2的激活可表現(xiàn)出“保護”和“損害”的雙重作用，并推測其可能與細胞類型及疾病所處的病理階段不同等因素相關，但具體作用機制仍不明確。最近研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶可激活星形膠質細胞表面PAR2，通過MAPK-NF-κB通路促進NO的合成與釋放。目前，針對小膠質細胞

4、PAR2激活介導神經炎癥反應的研究還十分有限。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，活化的肥大細胞可釋放類胰蛋白酶激活小膠質細胞表面PAR2，引起小膠質細胞活化，小膠質細胞活化后同樣通過MAPK通路促進BDNF的合成與釋放。因此，我們推測外源性添加類胰蛋白酶可激活小膠質細胞表面PAR2，進而促進小膠質細胞合成和釋放NO、TNF-α等炎癥因子，介導神經炎癥反應，導致周圍神經元損傷。
　　 綜上所述，鑒于小膠質細胞在中樞神經系統(tǒng)免疫炎癥反應中的重要作

5、用，本課題通過體外原代細胞培養(yǎng)等技術，研究類胰蛋白酶激活小膠質細胞PAR2后不同時間點NO、TNF-α、IL-1β等炎癥因子的釋放情況，并觀察其對體外培養(yǎng)神經元存活的影響，旨在探索PAR2在小膠質細胞活化及其介導神經炎癥反應中的作用，也期望為開發(fā)更有效的中樞神經系統(tǒng)損傷防治新策略提供作用靶點，具有理論和臨床意義。
　　 [研究方法]
　　 1.類胰蛋白酶干預小膠質細胞，檢測不同時間點培養(yǎng)上清液中BDNF、IL-1β、TN

6、F-α及NO的含量。
　　 體外分離純化培養(yǎng)大鼠皮質原代小膠質細胞，添加類胰蛋白酶(Tryptase)20U/ml，隨后分別在第0,0.5，1，2，12，24和72h收集小膠質細胞培養(yǎng)上清液(microgliaconditioningmedium，MCM)，通過ELISA法檢測上清液中BDNF、IL-1β及TNF-α含量，Griess法測定上清液中NO2-含量作為衡量NO水平的指標。
　　 2.利用PAR2特異性激動劑、

7、抑制劑及RNA干擾技術，探索PAR2在類胰蛋白酶激活小膠質細胞介導炎癥反應中的作用。
　　 體外分離純化培養(yǎng)大鼠皮質小膠質細胞，實驗分4組。對照組；實驗組一：體外培養(yǎng)小膠質細胞+SLIGRL-NH2(PAR2特異性激動劑)；實驗組二：體外培養(yǎng)小膠質細胞+FSSRY-NH2(PAR2特異性抑制劑)+Trypmse；實驗組三：體外培養(yǎng)小膠質細胞+PAR2shRNA+Tryptase，24h后收集細胞培養(yǎng)上清液，Griess法測定比較

8、不同組別NO水平。
　　 3.類胰蛋白酶激活小膠質細胞對體外培養(yǎng)神經元存活的影響。
　　 體外分離培養(yǎng)大鼠皮質神經元，實驗分3組。對照組：體外培養(yǎng)神經元+未經類胰蛋白酶處理的MCM；早期組：體外培養(yǎng)神經元+類胰蛋白酶處理后第1h收集MCM；晚期組：體外培養(yǎng)神經元+第72h收集的MCM，再培養(yǎng)神經元48h，隨后通過流式細胞技術和TUNEL染色檢測神經元凋亡情況。
　　 4.統(tǒng)計學處理
　　 數(shù)據(jù)使用SPSS

9、13.0統(tǒng)計軟件進行分析，結果以X±SD表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，p≤0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 [研究結果]
　　 1.類胰蛋白酶干預早期BDNF釋放短暫性升高，晚期TNF-α等炎癥因子含量逐漸增加
　　 檢測結果顯示，類胰蛋白酶激活小膠質細胞后早期MCM中BDNF含量迅速增加，在1h釋放達到高峰，但72h內逐漸下降至起始水平；與之相反，IL-1β、TNF-α及

10、NO的含量則隨時間推移逐漸升高，在最后一次測量時間點(72h)仍保持較高水平。
　　 2.類胰蛋白酶通過激活小膠質細胞PAR2介導炎癥反應
　　 PAR2特異性激動劑SLIGRL-NH2顯著增加小膠質細胞培養(yǎng)上清液中NO的含量，與對照組相比較差異具有統(tǒng)計學意義(11.24±1.09VS2.25±0.26，p＜0.05)；用PAR2抑制劑和慢病毒預處理小膠質細胞后，再用類胰蛋白酶干預小膠質細胞，培養(yǎng)上清液中NO的含量與對照

11、組相比，無明顯差異(2.53±0.40VS2.25±0.26，p＞0.05；2.25±0.27VS2.25±0.26，p＞0.05)，表明類胰蛋白酶是通過激活PAR2介導小膠質細胞NO的釋放。
　　 3.類胰蛋白酶干預晚期的MCM促進體外培養(yǎng)神經元凋亡
　　 流式細胞術檢測結果：晚期組神經元凋亡率明顯增加，與對照組和早期組相比較差異具有統(tǒng)計學意義(13.60％±1.51％VS3.33％±0.51％，p＜0.05；13.6

12、0％±1.51％VS3.27％±0.42％，p＜0.05)；而早期組和對照組相比較，神經元凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(3.33％±0.51％VS3.27％±0.42％，p＞0.05)。TUNEL染色結果：晚期組免疫熒光強度和陽性細胞數(shù)明顯高于對照組和早期組，差異具有統(tǒng)計學意義(17.67％±0.45％VS5.57％±1.35％，p＜0.05；17.67％±0.45％VS6.67％±0.47％，p＜0.05)。
　　 [研究結論]