泛素連接酶Parkin通過蛋白酶體與異體自噬途徑介導(dǎo)對蝦的抗病毒免疫反應(yīng).pdf

1、白斑綜合癥病毒簡稱為WSSV(White spot syndrome virus，WSSV)危害水產(chǎn)養(yǎng)殖界，它能感染多種蝦、蟹等多種甲殼類動物。由WSSV引起的白斑病導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖出現(xiàn)高致死率并帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究宿主先天免疫系統(tǒng)抗病毒的機(jī)制，對預(yù)防和控制甲殼類大規(guī)模爆發(fā)病毒性疾病具有重要意義。前期研究發(fā)現(xiàn)，泛素化和類泛素化途徑在對蝦的抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用。E3泛素連接酶Parkin作為線粒體質(zhì)量控制的分子，在線粒體自噬中

2、發(fā)揮重要作用。最近又報(bào)道Parkin能夠通過類似線粒體自噬的途徑清除胞內(nèi)的病原菌。但是一些詳細(xì)機(jī)理還不清楚。通過轉(zhuǎn)錄組測序在日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)中鑒定出了泛素連接酶Parkin，我們把它其命名為sParkin(shrimp Parkin)。sParkin的cDNA全長1656bp，這里面含有一個完整的開放閱讀框含為552個氨基酸。其中包含N端的泛素樣結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-like UBQ)和其

3、后的RING0，RING1,RING2結(jié)構(gòu)域。組織分布顯示sParkin在對蝦的主要器官如心臟、肝胰腺、胃、鰓、腸及血細(xì)胞中表達(dá)。進(jìn)一步的研究顯示在mRNA和蛋白質(zhì)水平上，sParkin能夠響應(yīng)病毒刺激表達(dá)量上調(diào)。而干擾sParkin后，對蝦體內(nèi)病毒量明顯高于對照組。注射重組蛋白能降低感染W(wǎng)SSV的對蝦的死亡率。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明sParkin可能參與了對蝦的抗病毒免疫。進(jìn)一步對其抗病毒機(jī)理進(jìn)行了研究，首先利用體外Pulldown實(shí)驗(yàn)證實(shí)

4、rsParkin能夠結(jié)合WSSV病毒的四個囊膜蛋白VP19,VP24,VP26和VP28。免疫電鏡顯示rsParkin能夠結(jié)合在WSSV的表面。免疫組化也證明sParkin與WSSV共定位。通過體外泛素化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了rsParkin能夠介導(dǎo)WSSV囊膜蛋白VP19,VP24,VP26和VP28的泛素化。進(jìn)一步用蛋白酶體抑制劑和自噬抑制劑注射對蝦，結(jié)果發(fā)現(xiàn)都能夠加快對蝦體內(nèi)WSSV的復(fù)制。說明sParkin可能是通過蛋白酶體降解囊膜蛋白或通

5、過類似線粒體自噬的方式（稱為異體自噬)清除病毒。為此我們進(jìn)一步檢測了自噬基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)病毒刺激可以上調(diào)自噬基因的表達(dá)。而干擾sParkin后，自噬基因ATG5和LC3的表達(dá)量下降。干擾sParkin，VP28的表達(dá)量升高，而在干擾ATG5的對蝦中回補(bǔ)sParkin，VP28的表達(dá)量會下降。表明rsParkin能夠修復(fù)ATG5介導(dǎo)的抗WSSV的能力。以上結(jié)果表明進(jìn)入胞內(nèi)WSSV病毒的囊膜蛋白被sParkin泛素化修飾，通過蛋白酶體和異體