基于細(xì)胞微陣列篩選泛素—蛋白酶體通路底物的研究.pdf

1、本研究借鑒并優(yōu)化了細(xì)胞微陣列技術(shù)，結(jié)合綠色熒光蛋白質(zhì)GFP標(biāo)簽、激光掃描共聚焦顯微鏡以及反式轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立了包含112個帶GFP標(biāo)簽的cDNA表達(dá)載體的蛋白質(zhì)定位微陣列，根據(jù)泛素-蛋白酶體抑制劑作用后，細(xì)胞內(nèi)形成的特征性“點(diǎn)”狀結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對泛素化蛋白質(zhì)的快速篩選。我們發(fā)現(xiàn)，有40個蛋白質(zhì)在泛素-蛋白酶體抑制劑MG-132處理后形成了聚集點(diǎn)。更重要的是，其中24個蛋白質(zhì)，如：MAPKAPK3，NLK和RhoG12等，從未見有與泛素-蛋白酶

2、體相關(guān)的文獻(xiàn)報道，而這些蛋白質(zhì)所對應(yīng)的內(nèi)源蛋白質(zhì)同樣在MG-132處理后形成了類似的“點(diǎn)”狀結(jié)構(gòu)。Western blot分析表明67％出現(xiàn)聚集點(diǎn)的蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)，內(nèi)外源免疫沉淀實(shí)驗(yàn)則證實(shí)這些聚集的蛋白質(zhì)發(fā)生了泛素化修飾。TNF-α激活NF-κB通路中主要元件的驗(yàn)證篩選，表明該篩選體系特異識別48位多泛素化鏈修飾的蛋白質(zhì)。 隨著通量化克隆構(gòu)建技術(shù)的出現(xiàn)及自動化圖像采集分析技術(shù)的日漸成熟，進(jìn)一步研究有可能建立一個基于活細(xì)胞體內(nèi)分