泛素蛋白酶體途徑對高糖刺激的腎系膜細胞NF-κB-IκB信號通路的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(DN)是糖尿病特有而常見的嚴重微血管并發(fā)癥之一，已成為西方國家引發(fā)終末期腎病(ESRD)的首要原因。DN的發(fā)病機制仍未完全清楚，系膜細胞在DN發(fā)病過程中起著重要作用。在DN的發(fā)生發(fā)展中，氧化應激、糖基化終末產(chǎn)物、蛋白激酶C以及腎素-血管緊張素系統(tǒng)等都可引起核因子-kB(NF-kB)的活化，活化的NF-kB致炎性細胞因子、黏附分子、趨化因子等明顯增多，從而引起腎臟間質炎癥反應和間質纖維化，參與DN的發(fā)生，故NF-kB在D

2、N的發(fā)生和發(fā)展中有中樞調(diào)節(jié)作用。而泛素-蛋白酶體途徑(UPP)是細胞內(nèi)損傷蛋白質特異性降解的主要途徑?，F(xiàn)已公認NF-kB信號通路關鍵分子-IkB的降解受UPP調(diào)節(jié)。但糖尿病腎病時UPP與NF-kB/IkB信號通路間關系尚見文獻報道，故本研究用高糖刺激大鼠腎小球系膜細胞(GMC)，觀察泛素化蛋白及信號蛋白NF-kB、IkB-α的表達，并以蛋白酶體特異性抑制劑MG132作為阻斷劑，探討泛素蛋白酶體途徑對高糖刺激的腎小球系膜細胞NF-kB/I

3、kB信號通路的影響，為DN的防治提供新理論。 方法： 1．將體外培養(yǎng)的大鼠HBZY-1腎小球系膜細胞株用5.6mmol/L(正常對照)、30mmol/L葡萄糖和不同濃度(0.5、1、2、3、4umol/L)的MG132處理各組細胞12～48小時，MTT法檢測高糖和不同濃度MG132對GMC增殖情況影響并繪制細胞生長曲線。 2．用不同濃度葡萄糖作為刺激因素，并用蛋白酶體抑制劑MG132作為阻斷劑作用于大鼠腎系膜細胞

4、，免疫印跡法檢測總NF-kB、IkB-α蛋白的表達及泛素化總蛋白的表達；細胞免疫熒光染色法及激光共聚焦顯微鏡檢測各組系膜細胞NF-kB的表達。 細胞分組為： ①正常對照組(葡萄糖濃度5.6mmol/L)； ②10mmol/L葡萄糖組； ③20mmol/L葡萄糖組； ④30mmol/L葡萄糖組、 ⑤甘露醇組(24.4mmol/L甘露醇作為滲透壓對照)、； ⑥5.6mmol/L葡萄糖加

5、MG132(1 μmol/L)組； ⑦20mmol/L葡萄糖糖加MG132(1 μmol/L)組； ⑧30mmol/L葡萄糖加MG132(1 μmol/L)組。 結果： ①在培養(yǎng)48h以內(nèi)，低濃度MG132(≤1μmol/L)和30mmol/L的高糖對GMC生長無明顯影響；MG132濃度>1umol/L時，隨著濃度的增加，MG132對GMC抑制作用增強。 ②與對照組相比，20mmol/L、30mm

6、ol/L葡萄糖作用12h和10mmol/L葡萄糖對GMC內(nèi)IkB-α蛋白的表達無明顯影響；20mmol/L和30mmol/L葡萄糖作用GMC24h～48h后IkB-α蛋白的表達明顯下降(p<0.01)，且具有時間、濃度依賴效應。與高糖組比較，高糖組加入MG132后，系膜細胞IkB-α蛋白的表達增強(P<0.01)。 ③免疫印跡法顯示GMC中總NF-kBp65蛋白表達在不同濃度葡萄糖組的表達差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)；但細胞免

7、疫熒光染色法及激光共聚焦顯微鏡檢測顯示：高糖作用的GMC胞核中NF-kBp65表達明顯增加(P<0.01)，具有時間、濃度依賴效應。高糖組加入MG132后，GMC胞核中NF-kBp65表達被明顯抑制(P<0.01)。④高糖可促進GMC泛素化蛋白的表達增加(P<0.01)，高糖對促進腎小球系膜細胞泛素化蛋白表達增加作用具有時間、濃度依賴效應。 結論： ①.高糖可促進大鼠腎小球系膜細胞總泛素化蛋白表達增加，IκB-α蛋白泛素