SUMO化修飾對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞NF-κB 信號(hào)的調(diào)控研究.pdf

1、 目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者發(fā)生腎功能衰竭的常見原因。越來越多的證據(jù)表明炎癥在糖尿病腎病發(fā)病過程中起著極其重要的作用,糖代謝紊亂與血流動(dòng)力學(xué)異?？捎|發(fā)炎癥反應(yīng),在早期腎組織中即出現(xiàn)單核-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),分泌過多炎癥因子,造成腎組織破壞和腎臟纖維化。核因子κB ( nuclear factor-κB, NF-κB)信號(hào)是目前公認(rèn)的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要信號(hào)通路,IKKγ又名NEMO(NF-κ

2、B essential modulator),是IκB激酶(IκB kinase, IKK)的調(diào)節(jié)亞基, IKKγ與IκB共同介導(dǎo)了NF-κB信號(hào)經(jīng)典激活途徑,在糖尿病腎病發(fā)病過程中扮演著重要的角色。小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin related modifier, SUMO)修飾是與泛素化類似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式,它通過與靶蛋白共價(jià)結(jié)合,影響蛋白間的相互作用、靶蛋白分布和穩(wěn)定性,參與了NF-κB、TGF-β、MAP

3、K等信號(hào)通路的調(diào)控。NF-κB、TGF-β、MAPK等信號(hào)通路參與糖尿病腎病的發(fā)病,但SUMO是否參與糖尿病腎病的信號(hào)調(diào)控鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。為此,本研究觀察不同作用濃度/時(shí)間的高糖刺激后大鼠腎系膜細(xì)胞(GMC)的SUMO分子( SUMO1、SUMO2/3 )、NF-κB信號(hào)分子( IKKγ、IκBα、NF-κB )和炎癥因子MCP-1 等的蛋白及基因表達(dá),使用免疫共沉淀及共聚焦顯微鏡研究SUMO蛋白與NF-κB信號(hào)分子(IκBα、IKKγ)

4、間的相互作用,旨在探討SUMO化修飾在糖尿病腎病NF-κB信號(hào)激活過程中的調(diào)控作用,為糖尿病腎病的防治提 供新理論。方法：大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMC)體外培養(yǎng),分別給與不同處理因素,分為以下各組：正常對(duì)照組(NC組)： 含5.6mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基 ；高糖干預(yù)組(HG1組,HG2和HG3組)：培養(yǎng)基糖濃度分別為10mmol/L 、20mmol/L 和30mmol/L；滲透壓對(duì)照組( OP組)：培養(yǎng)基含5.6mmol/L葡萄糖和24

5、.4mmol/L甘露醇。各組細(xì)胞培養(yǎng)6、12、24h小時(shí)后,用免疫印跡(Western-blot)、RT-PCR、免疫熒光( IF )激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組細(xì)胞SUMO1、SUMO2/3、IKKγ、IκBα、NF-κBp65表達(dá)及亞細(xì)胞定位；用免疫共沉淀(Co-IP)和免疫熒光雙染共定位檢測(cè)SUMO1、SUMO2/3分別與IKKγ、IκBα蛋白間的相互作用,用RT-PCR檢測(cè)NF-κB信號(hào)下游炎癥因子MCP-1 mRNA表達(dá)。3、統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)分析：應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1、與NC 組比較,不同濃度高糖作用不同時(shí)間均可上調(diào)系膜細(xì)胞SUMO1 、SUMO2/3蛋白和 mRNA表達(dá)( P均 <0.05),提示高糖呈時(shí)間和濃度依賴性增強(qiáng)SUMO表達(dá)；2、與NC 組比較,高糖干預(yù)組IκBα蛋白表達(dá)減弱(均P<0.05),且具

7、有時(shí)間、濃度依賴效應(yīng)；但高糖作用后IKKγ的蛋白和mRNA表達(dá)均無顯著變化( P均>0.05 )；3、與NC組比較,高糖和高滲透壓組可減弱IKKγ、IκBα與SUMO1、SUMO2/3之間的相互結(jié)合(均P<0.05 ) ,但高糖可特異性影響SUMO2/3與IκBα間的相互作用,與滲透壓無關(guān)；4、與NC組比較,高糖呈濃度和時(shí)間依賴性地增強(qiáng) NF-κBp65蛋白和MCP-1 mRNA表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論：1、SUMO1、SUMO2/3